III. METODE PENELITIAN

III. METODE PENELITIAN A. Tahap Laboratorium 1. Uji Kemampuan Isolat a. Tempat dan Waktu Penelitian Uji kemampuan 40 isolat bakteri dilaksanakan di laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Pengujian dilakukan pada bulan Juli 2014 Desember 2014. b. Bahan dan Alat 1) Bahan Bahan yang dibutuhkan pada tahap ini meliputi 40 isolat bakteri awal, media YMA (Yeast extract mannitol agar), media Jensen, dan media Pikovskaya. 2) Alat Alat yang digunakan antara lain petridish, autoclave, jarum ose, tabung reaksi, dan kaca pembesar. c. Pelaksanaan Penelitian Isolat-isolat bakteri yang digunakan telah melewati pengujian antagonistik terhadap Foce secara in vitro. Berdasarkan pengujian tersebut, diketahui 28 diantaranya mampu menghambat perkembangan Foce. Dua puluh delapan isolat tersebut, yaitu B1, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B11, B12, B13, B18, B20, B21, B22, B23, B24, B25, B26, B27, B29, B31, B34, B35, B36, B37, B38, B40. Empat puluh isolat bakteri awal diuji secara in vitro pada media selektif untuk mengetahui kemampuan menyediakan unsur hara. Pengujian menambat nitrogen menggunakan media tanpa nitrogen yaitu media YMA dan media Jensen. Pengujian melarutkan fosfat menggunakan media dengan fosfat tidak terlarut yaitu media Pikovskaya. Setiap isolat bakteri tersebut digoreskan pada masing-masing media selektif sebanyak dua ulangan. Pengamatan dilakukan dua hari kemudian. 11

12 d. Pengamatan Peubah 1) Bakteri penambat nitrogen Isolat bakteri yang mampu hidup dengan baik pada media selektif bebas nitrogen (YEMA dan/atau Jensen) merupakan bakteri penambat nitrogen secara in vitro 2) Bakteri pelarut fosfat Isolat bakteri yang mampu melarutkan fosfat akan membentuk zona bening di sekeliling koloni. e. Analisis Data Data yang diperoleh dari uji kemampuan isolat bakteri digunakan untuk mengelompokkan bakteri sebagai acuan rancangan perlakuan tahap selanjutnya. 2. Uji Viabilitas pada Carrier a. Tempat dan Waktu Penelitian Uji viabilitas pada berbagai macam carrier dilakukan di laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret, Surakarta pada bulan Desember 2014-Maret 2015. b. Bahan dan Alat 1) Bahan Bahan yang digunakan antara lain: 40 isolat bakteri awal, media NA (Nutrient agar), zeolit, gambut, limbah budidaya jamur, dan media Nutrient Broth. 2) Alat Alat yang digunakan meliputi: petridish, tabung reaksi, autoclave, timbangan analitis, mikropipet, stoples inkubasi, hand colony counter, dan kaca pembesar. c. Perancangan Penelitian Penelitian dilaksanakan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap dengan dua faktor, yaitu konsorsium bakteri dan komposisi carrier. Masingmasing formulasi diulang 2 kali, sehingga terbentuk rancangan perlakuan sebagai berikut:

13 B0C1 B1C1 B2C1 B3C1 B0C2 B1C2 B2C2 B3C2 B0C3 B1C3 B3C2 B3C3 Keterangan B0 : Kontrol (tanpa inokulasi bakteri) B1 : Konsorsium bakteri antagonis terhadap Foce B2 : Konsorsium bakteri penyedia unsur hara B3 : Konsorsium bakteri multifungsi C1 : Carrier zeolit dan gambut C2 : Carrier zeolit, gambut dan limbah budidaya jamur C3 : Carrier cair (Nutrient Broth) d. Pelaksanaan Penelitian Tahap ini terdiri dari beberapa langkah, yaitu persiapan konsorsium bakteri, persiapan carrier, inokulasi konsorsium bakteri pada carrier, dan uji viabilitas. Persiapan konsorsium bakteri dilakukan dengan memperbanyak seluruh isolat bakteri pada media miring dalam tabung reaksi, kemudian disimpan selama 3 hari atau hingga seluruh permukaan media tertutup koloni bakteri. Koloni yang terbentuk merupakan koloni tunggal, jika terjadi kontaminasi maka akan dilakukan perbanyakan ulang. Langkah selanjutnya, yaitu menimbang bahan-bahan carrier yang akan digunakan, lalu memasukkannya dalam stoples penyimpanan formulasi. Setiap stoples berisi 100 gram carrier dengan perbandingan berat 1:1 dan 100 ml untuk carrier NB. Stoples tersebut ditutup menggunakan kain, kemudian disterilisasi menggunakan autoclave. Sterilisasi carrier dan stoples penyimpanan ini dilakukan saat semua perbanyakan isolat telah berhasil. Isolat-isolat bakteri dan carrier telah siap, maka selanjutnya melakukan inokulasi konsorsium bakteri pada carrier. Isolat-isolat bakteri tersebut dikelompokkan sesuai perlakuan, kemudian setiap kelompok bakteri tersebut dicampur dalam 10 ml garam fisiologis (10% dari berat carrier). Garam fisiologis yang berisi konsorsium tersebut dituangkan dalam carrier dan

14 dicampur merata. Semua langkah-langkah tersebut dilakukan secara aseptis. Stoples-stoples tersebut ditutup dan disimpan pada suhu ruang. Setelah semua formulasi telah terbentuk, selanjutnya melakukan uji viabilitas. Viabilitas mikroba selama masa penyimpanan diuji berdasarkan kepadatan populasi mikroba per gram atau ml contoh pupuk yang dihitung dengan teknik pengenceran bertingkat (10 1 10 7 ). Mikroba dalam larutan yang sudah diencerkan ditumbuhkan dalam media agar NA dengan metode spread plate. Seri pengenceran yang ditumbuhkan adalah 10-3, 10-5, 10-7 (untuk masa simpan 0 hari) dan 10-1, 10-3, 10-5 (untuk masa simpan 3 dan 6 minggu). Setiap seri pengenceran yang ditanam, diulang 2 kali. Koloni yang tumbuh pada media NA dihitung sebagai nilai kepadatan dan diamati sebagai perhitungan indeks keragaman. Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali, yaitu langsung setelah konsorsium bakteri diinokulasikan, 3 minggu setelah inokulasi, dan 6 minggu setelah inokulasi. e. Pengamatan Peubah 1) Kepadatan populasi bakteri Kepadatan populasi dapat diketahui dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media NA (pada setiap seri pengenceran). Jumlah koloni yang memenuhi syarat yaitu antara 30-300 koloni, jika memenuhi syarat tersebut maka selanjutnya dihitung dalam bentuk CFU/g, kemudian angkat tersebut diubah dalam bentuk logaritma. 2) Keragaman bakteri Keragaman bakteri diketahui dengan cara mengidentifikasi kolonikoloni yang tumbuh pada media NA dan dihitung jumlah koloni yang memiliki morfologi sama. Jumlah koloni tersebut dihitung menggunakan metode Shannon-indeks (H). Perhitungan indeks keragaman Shannon- Wiener (H ) menggunakan rumus: ; f. Analisis Data Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis menggunakan ANOVA, lalu dilanjutkan dengan uji duncan 5% untuk mengetahui signifikansi dari setiap perlakuan.

15 B. Uji In Vivo pada Lahan Degradatif 1. Tempat dan Waktu Penelitian Persiapan formulasi perlakuan pada uji in vivo pada lahan degradatif dilaksanakan di laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret pada bulan Mei 2015. Aplikasi formulasi-formulasi tersebut dilakukan pada lahan degradatif yang teretak di desa Gondosuli, Tawangmangu, Karanganyar pada bulan Mei 2015 sampai dengan Oktober 2015. 2. Bahan dan Alat a. Bahan Bahan yang digunakan meliputi: 40 isolat bakteri awal, media NA, media NB, zeolit, gambut, limbah budidaya jamur, benih Bawang Putih varietas Tawangmangu Baru, tanah dari desa Pancot. b. Alat Alat yang diperlukan antara lain: autoclave, shaker, botol kultur bakteri, pot inkubasi, dan peralatan budidaya Bawang Putih. 3. Perancangan Penelitian Penelitian pada tahap ini merupakan pengaplikasian formulasi-formulasi pada tahap uji viabilitas pada lahan degradatif terhadap tanaman bawang. Selain formulasi-formulasi tersebut juga ditambahkan beberapa perlakuan kontrol yang menjadi perbandingan. Penelitian dilaksanakan dengan metode Rancangan Acak Kelompok Lengkap. Setiap petak formulasi diulang 3 kali, setiap petak terdiri dari 10 tanaman dengan jarak tanam 15 cm 15 cm. Sehingga, terbentuk rancangan perlakuan: Kontrol B0C1 B1C1 B2C1 B3C1 KG B0C2 B1C2 B2C2 B3C2 KP B0C3 B1C3 B2C3 B3C3 Keterangan Kontrol : Tanpa masukan carrier KG : Cara budidaya petani Bawang Putih desa Gondosuli KP : Tanah dan cara budidaya petani Bawang Putih desa Pancot B0 : Kontrol (tanpa inokulasi bakteri)

16 B1 : Konsorsium bakteri antagonis terhadap Foce B2 : Konsorsium bakteri Penyedia Unsur Hara B3 : Konsorsium bakteri multifungsi (penambat nitrogen dan/atau pelarut fosfat dan/atau antagonis terhadap Foce) C1 : Carrier zeolit dan gambut C2 : Carrier zeolit, gambut, dan limbah budidaya jamur C3 : Carrier cair (Nutrient Broth) 4. Pelaksanaan Penelitian Penelitian diawali dengan persiapan formulasi yang akan diaplikasikan. Perbanyakan konsorsium bakteri dilakukan dengan cara membuat konsorsium bakteri dalam media NB (suspensi bakteri) dan diperbanyak secara bertingkat. Mula-mula membuat 3 konsorsium bakteri (antagonis terhadap Foce, penyedia unsur hara, dan multifungsi) dalam 10 ml NB. Konsorsium-konsorsium tersebut diletakkan pada alat shaker selama satu jam/ hari selama 3 hari, kemudian 10 ml konsorsium tersebut dicampur dalam 90 ml NB, sehingga terbentuk 100 ml larutan NB yang berisi konsorsium bakteri. Persiapan carrier yang dilakukan sama seperti pada tahap uji viabilitas, namun dengan skala yang lebih besar yaitu 700 gram. Carrier yang telah siap, dicampur dengan 70 ml larutan NB yang berisi konsorsium bakteri. Formulasiformulasi tersebut disimpan dalam pot inkubasi untuk carrier padat dan tabung erlenmeyer untuk carrier cair. Formulasi-formulasi tersebut diinkubasi selama 3 minggu. Setelah 3 minggu inkubasi, formulasi-formulasi tersebut diaplikasikan pada petakan seberat 225 gram/petak serta mengolah tanah. Persiapan perlakuan cara budidaya petani Bawang Putih desa Gondosuli (KG) dilakukan aplikasi pupuk SP36, Phonska, dan pupuk kandang berasal dari kotoran ayam. Persiapan perlakuan tanah dan cara budidaya petani Bawang Putih desa Pancot (KP), dilakukan dengan membuat lubang petakan sedalam 50 cm, kemudian diisi dengan tanah berasal dari desa Pancot (lahan produktif-supresif) serta dipupuk menggunakan kompos kotoran kambing dengan rumput kering, dan pupuk urea.

17 Perlakuan-perlakuan tersebut didiamkan selama satu minggu, sebelum ditanam benih Bawang Putih. Penanaman dilakukan tepat 7 hari setelah pengolahan tanah. Penyulaman masih dilakukan hingga 7 hari setelah tanam. Pengamatan yang dilakukan selama masa tanam, meliputi insiden penyakit dan tinggi tanaman. Pengamatan insiden penyakit dilakukan dengan cara menghitung tanaman yang mati akibat BPB per petak perlakuan. Selama masa tanam juga dilakukan perawatan, penyiraman dan penyiangan, namun tidak dengan pemupukan susulan. Pada saat panen akan dilakukan pengamatan umbi sehat, umbi busuk, berat umbi, diameter umbi, panjang akar, berat basah tanaman, dan berat kering tanaman. 5. Pengamatan Peubah a) Insiden penyakit Insidens penyakit diamati pada setiap minggu selama masa tanam. Nilai insiden penyakit dihitung per petak perlakuan. Insiden penyakit dihitung dengan rumus: Insidens penyakit = b) Tinggi tanaman Tinggi tanaman diukur pada saat panen. Pengukuran dilakukan terhadap 5 tanaman sampel dari 10 tanaman per petak perlakuan. Tinggi tanaman diukur pada bagian pangkal batang semu hingga daun terpanjang. c) Berat brangkasan (tanaman atas dan akar) Tanaman bawang putih yang dipanen dipisahkan antara batang (bagian atas), umbi, dan akar. Batang dan akar ditimbang sesaat setelah dicabut dari tanah, sebagai berat basah tanaman. Bagian batang dan akar terbut dikeringkan dalam oven selama ±48 jam dengan suhu ±80 C. Setelah beratnya konstan, brangkasan ditimbang kembali untuk mengetahui nilai berat kering tanaman. Tanaman yang ditimbang untuk berat brangkasan hanya 5 tanaman sampel dari 10 tanaman per petak. d) Berat umbi

18 Umbi pada setiap tanaman dipisahkan dari batang dan akar. Umbi-umbi tersebut ditimbang sesaat setelah dicabut dari tanah. Penimbangan berat umbi dilakukan dua kali, yaitu berat umbi 5 tanaman sampel dari 10 tanaman per petak dan 10 tanaman per petak. 6. Analisis Data Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis menggunakan ANOVA, lalu dilanjutkan dengan uji duncan 5% untuk mengetahui signifikansi dari setiap perlakuan.