Kata kunci : aktifitas antioksidan, DPPH, GAE, kandungan total fenol

STUDI KANDUNGAN TOTAL FENOL DAN AKTIFITAS ANTIOKSIDAN PADA BEBERAPA EKSTRAK TUMBUHAN BERPOTENSI SEBAGAI ANTIOKSIDAN Lasmaryna Sirumapea, David Darwis, Novi Nurleni, Essi Vindiani, Tiara Aprilianti Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Bhakti Pertiwi Email : lasmaryna2906@gmail.com Abstrak Kandungan fenol pada tumbuhan sangat memengaruhi kemampuan tumbuhan tersebut sebagai antioksidan. Pada studi ini, diteliti sejauh mana hubungan antara kandungan total fenol pada ekstrak suatu tanaman dengan kemampuan tanaman tersebut sebgai antioksidan. Sampel yang diteliti terdiri dari dua kelompok. Kelompok pertama adalah ekstrak dan hasil fraksinasi dengan pelaaarut h-heksan, etil asetat dan air dari ekstrak daun manggis. Kelompok kedua adalah ekstrak beberapa daun yang memiliki aroma khas, yaitu daun kunyit, daun lengkuas dan daun kencur. Aktifitas antioksidan diwakili oleh nilai IC-50. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Pengujian aktifitas antioksidan didasarkan atas besarnya penurunan serapan senyawa DPPH (2,2 diphenyl- 1-pycrylhydrazyl) setelah bereaksi dengan ekstrak menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Kandungan total fenol ditentukan dengan nilai GAE (Galic Acid Equivalent mg/g) menggunakan pereaksi Follin-Ciautelcau. Nilai kandungan total fenol dan IC-50 dari kelompok ekstark pertama adalah sebagai berikut : ekstrak total 32,71 mg/g dan 66,72 ppm; fraksi air 35,69 mg/g dan 63,42 ppm; fraksi etil asetat 27,56 mg/g dan 84,4 ppm; fraksi n-heksan 6,71 mg/g dan 188,25 ppm. Nilai kandungan total fenol dan IC-50 dari kelompok ekstrak kedua adalah sebagai berikut : ekstrak daun lengkuas 14,99 mg/g dan 86,68 ppm; ekstrak daun kunyit 12,7 mg/g dan 126,59 ppm; ekstrak daun kencur 11,025 mg/g dan 174,38 ppm. Dari hasil pengujian kelompok pertama, diperoleh koefisien korelasi antara kandungan total fenol dan nilai IC-50 (R 2 ) adalah sebesar 0,9826. Kelompok kedua memberikan nilai koefisien korelasi sebesar 0,9896. Hal ini menunjukkan bahwa aktifitas antioksidan sangat dipengaruhi kandungan total fenol yang terdapat pada tumbuhan tersebut. Kata kunci : aktifitas antioksidan, DPPH, GAE, kandungan total fenol PENDAHULUAN Antioksidan merupakan senyawa yang dapat memperlambat atau mencegah terjadinya kerusakan yang diakibatkan oleh radikal bebas dengan jalan meredam aktivitas radikal bebas atau memutus rantai reaksi oksidasi yang disebabkan oleh radikal bebas (Miryanti et al, 2011). Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif, akibatnya kerusakan sel akan terhambat (Winarsi, 2007). Akhir-akhir ini, penggunaan antioksidan alami semakin meluas., dikarenakan faktor risiko yang lebih kecil dibandingkan antioksidan yang berasal dari senyawa sintetis atau fabrikan (Khairunissa, 2011). Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 275 Peran Apoteker dalam Menjamin Mutu, Efektifitas, Keamanan pada Obat, Makanan dan Kosmetik

Beberapa contoh antioksidan yang terdapat dalam tanaman adalah beta karoten, likopen, vitamin C, vitamin E, flavonoid, kurkuminoid, dan golongan senyawa polifenol (Winarsi, 2007). Senyawa fenol atau polifenol antara lain dapat berupa golongan flavonoid. Banyak penelitian yang telah menyatakan bahwa senyawa golongan fenol memiliki potensi sebagai antioksidan karena memiliki gugus hidroksil yang terikat pada karbon cincin aromatik sehigga dapat menangkap radikal bebas yang dihasilkan dari reaksi peroksidasi lemak. Senyawa golongan fenol akan menyumbangkan satu atom hidrogen untuk menstabilkan radikal peroksi lemak (Dewi, 2014). Dari beberapa penelitian, terlihat adanya hubungan antara aktifitas antioksidan dengan jumlah total kadar fenolik dari sampel yang dianalisa. Pada berbagai macam kulit batang kapuk yang diuji menunjukkan bahwa kandungan total fenol yang paling besar memiliki aktifitas niliai IC50 paling rendah, sedangkan pada kulit kapuk batang kapuk yang memiliki kandungan total fenol paling rendah memiliki nilai IC50 yang paling besar (Hardiana, 2012). Penelitian ini bertujuan melihat hubungan kuantitatif antara kandungan total fenol suatu ekstrak dengan kemampuan ekstrak tersebut sebagai antioksidan. ALAT DAN BAHAN Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain: Seperangkat alat maserasi, seperangkat alat destilasi, seperangkat alat rotary evaporator, timbangan analitik, pipet volume, vial, corong, kertas saring, kapas, tabung reaksi, pipet tetes, batang pengaduk, gelas ukur, gelas kimia, labu ukur, plat tetes, spektrofotometri UV-VIS Tipe PG-60 Bahan-bahan yang digunakan antara lain adalah : daun manggis (Garcinia mangostana L), daun kencur (Kaempferia galanga L) daun kunyit (Curcuma longa L) dan daun lengkuas (Alpinia galanga L), pereaksi DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazil), etanol 96% (C2H5OH), aquadest (H2O), metanol (CH3OH), kloroform (CHCl3), asam sulfat (H2SO4), etil asetat (CH3COOC2H5), n-heksan (C6H14), pereaksi Mayer, Na2CO3, dan pereaksi Libermann-Buchard, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. METODOLOGI PENELITIAN Preparasi Sampel Identifikasi golongan fenol Daun manggis (Garcinia mangostana L ), daun kunyit (Curcuma Longa L.), daun lengkuas ( Alpina galanga L.) dan daun kencur (Kaemferia galanga L.), disortir dan dibersihkan terlebih dahulu. Kemudian dirajang dan ditimbang sebanyak 1 kg. Sampel dikelompokkan menjadi dua bagian yaitu : sampel (1) ekstrak daun manggis dan fraksinya, dan sampel (2) ekstrak dari daun-daun yang beraroma khas, yaitu daun kunyit, daun lengkuas dan daun kencur. Sebanyak 4 gram sampel segar dipotong halus dan didihkan dengan 25 ml etanol selama 15 menit, disaring selagi panas, kemudian filtrat diuapkan sampai kering, ekstrak yang didapat ditambahkan kloroform dan air suling (1:1) sebanyak 5 ml masing-masing, kocok biarkan sejenak sehingga terbentuk kloroform dan lapisan air. Pemeriksaan fenolik, sebagian dari lapisan air ditambahkan besi (III) klorida, reaksi dinyatakan positif bila terjadi perubahan warna menjadi biru atau hitam. Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 276

Ekstraksi dan Fraksinasi Sampel segar daun manggis, daun kunyit, daun kencur dan daun lengkuas yang sudah disortir, dirajang dan ditimbang sebanyak 1 kg. Selanjutnya direndam dengan pelarut etanol 96% selama 3x5 hari. Saring, buang ampasnya. Ekstrak yang didapat kemudian diuapkan pelarutnya dengan alat vakum dan bantuan rotary evaporator. Terhadap ekstrak kental etanol daun manggis, dilanjutkan dengan fraksinasi. Fraksinasi menggunakan pelarut yang mewakili derajat kepolaran, yaitu n-heksan, etil asetat dan sisa (air). Pemeriksaan Aktivitas Antioksidan dengan Metode peredaman DPPH Pembuatan Larutan DPPH dan Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH ditimbang sebanyak 5 mg, dilarutkan dalam metanol hingga volume 250 ml, diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,05 mm. Sebanyak 3,8 ml larutan DPPH 0,05 mm dipipet dan ditambahkan dengan 0,2 ml metanol. Setelah dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap yang terlindung dari cahaya, serapan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum 516 nm. Pembuatan Larutan Sampel Sampel (1) yang berupa ekstrak kental dan hasil fraksinasi (fraksi air, fraksi etil asetat dan fraksi n-heksan) masingmasing ditimbang sebanyak 100 mg kemudian dilarutkan dengan metanol lalu dicukupkan sampai 100 ml didalam labu ukur 100 ml sehingga didapatkan konsentrasi larutan 1000 ppm sambil dikocok homogen. Lalu dibuat larutan sampel dengan konsentrasi 40, 80, 120, 160 dan 200 ppm. Ekstrak sampel beraroma dibuat dengan cara yang sama utk konsentrasi 50,100,200,250 dan 500 ppm. Pemeriksaan Aktivitas Antioksidan Sampel dipipet 0,2 ml lalu ditambah 3,8 ml larutan DPPH 0,05 mm, biarkan selama 30 menit ditempat gelap. Serapan diukur dengan spektofotmeter UV-Vis pada panjang gelombang serapan maksimum DPPH. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan untuk masing-masing konsentrasi larutan sampel. Kapasitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal bebas DPPH melalui perhitungan persentase inhibisi serapan DPPH dengan menggunakan rumus: AAAAAA CC AAAAAA (CC+SS) % inhibisi = xx 100 % AAAAAA CC Keterangan : Absorban C = Serapan radikal DPPH 0,05 mm pada AbsorbanC+S =Serapan sampel dalam radikal DPPH 0,05 mm Penentuan Nilai IC50 Penentuan IC50 dilakukan dengan memasukkan nilai hasil persamaan dengan menggunakan rumus Y = ax + b (Molyneux, 2003), yamg didapat dari data persentase inhibisi dari masing-masing konsentrasi. Dalam persamaan tersebut, nilai X adalah konsentrasi zat yang diukur sedangkan nilai Y merupakan serapan yang terukur dari sampel yang sedang diuji. Masukkan angka 50 untuk variabel Y, maka didapat nilai konsentrasi yang mampu menghambat aktifitas radikal bebas sebesar 50%. Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 277

Penentuan Kandungan Total Fenol Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat Dari larutan induk 1000 ppm larutan sampel diencerkan sehingga didapatkan konsentrasi larutan sebesar 25, 50, 75, 100, 125 mg/l asam galat. Dari masing-masing konsentrasi diatas dipipet 0,2 ml ditambah 10ml aquadest ditambah 1 ml reagen Folinciocalteu yang telah diencerkan lalu dikocok, diamkan selama 2 menit tambah 3 ml larutan Na2CO3 kocok homogen. Diamkan selama 1 jam pada suhu kamar. Ukur serapan pada panjang gelombang serapan maksimum 765 nm, lalu buat kurva kalibrasi hubungan antara konsentrasi asam galat (mg/l) dengan absorban. Penetapan Total Fenol Kandungan total fenol ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Sebanyak 0,1 ml ekstrak 0,1% dr ektrak dicampurkan dengan reagen Folin-Ciocalteu 10%. Campuran didiamkann pada suhu kamar selama 5 menit. Selanjutnya 0,75 ml Na2CO3 6% (w/v) ditambahkan ke dalam campuran. Campuran didiamkan pada suhu kamar selama 90 menit. Absorbansi sampel diukur pada λmaks = 745 nm menggunakan spectrometer UV-Vis. Kandungan total fenol dinyatakan sebagai mg/g ekivalen asam galat Penentuan Korelasi Total kandungan Fenol dan Aktifitas Antioksidan Korelasi antara Total kandungan Fenol dan Sktifitas Antioksidan dapat diketahui dari koefisien korelasi grafik total kandungan fenol dan aktifitas antioksidan. HASIL DAN BAHASAN Hasil pemeriksaan pendahuluan, keempat jenis tanaman yang diuji mengandung senyawa fenolik. Metode ekstraksi yang dipilih adalah maserasi (perendaman). Rendemen yang didapatkan dari ekstraksi maserasi terhadap keempat ekstrak adalah Tabel 1. Persen rendemen masing-masing ekstrak No Ekstrak % rendemen 1 Daun manggis 9,632 2 Daun kunyit 2,473 3 Daun kencur 1,857 4 Daunlengkuas 5,442 Persen inhibisi ekstrak adalah sbb : c,ppm % inhibisi Ekstr total Fraksi heksan f. etil asetat f. air 40 46,19 13,25 39,50 46,19 80 51,88 21,26 43,52 52,18 120 60,12 26,99 60,82 62,74 160 73,15 46,26 76,60 89,07 200 85,68 53,31 84,42 94,96 IC-50 66,72 188,25 84,39 63,42 Tabel 2. Nilai persen inhibisi dan IC-50 ekstrak dan fraksi daun manggis Panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum untuk larutan 0,05M DPPH adalah 517 nm. DPPH merupakan radikal sintesis yang dapat larut dalam pelarut organik polar seperti etanol dan metanol. Uji DPPH dilakukan dengan mengamati penurunan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm dengan spektroskopi UV-Vis. Penurunan nilai absorbansi sebagai akibat dari penurunan intansitas warna dari larutan yaitu dari warna ungu ke warna yang lebih pudar. Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 278

Tabel 3. Nilai persen inhibisi dan IC-50 C Inhibisi, % ekstrak, ppm Daun kunyit Daun kencur Daun lengkuas 50 46,80 45,33 47,97 100 47,38 47,89 49,83 200 50,59 50,59 56,62 250 53,50 53,50 59,34 500 59,98 59,98 67,88 IC-50 126,59 174,38 80,68 Penurunan intensitas warna ini terjadi karena penambahan radikal hidrogen dari senyawa antioksidan (dalam hal ini, adalah ekstrak yang digunakan) pada elektron yang tak berpasangan pada radikal nitrogen dalam struktur senyawa DPPH.Makin cepat nilai absorbansi turun atau makin cepat perubahan warna dari larutan, makin potensial antioksidan tersebut dalam mendonorkan hidrogen. Menurut Jadhav et al. (1996), antioksidan yang bersifat mendonorkan radikal hidrogen merupakan antioksidan pemutus rantai, atau dikenal sebagai antioksidan primer. Antioksidan primer akan bereaksi dengan radikal peroksil yang selanjutnya diubah menjadi radikal yang lebih stabil atau nonradikal. Dari data nilai absorbansi terlihat dari penurunan serapan larutan DPPH akibat membentuk hidroperoksida sebagai antioksidan sekunder sehingga menghambat pembentukan lipid peroksida (Kurniati., 2013) Pada hasil pemeriksaan, akan terlihat perubahan warna yang signifikan pada larutan DPPH. Warna larutan awal (tanpa adanya ekstrak atau fraksi kental tumbuhan), adalah ungu pekat cenderung hitam. Setelah larutan DPPH direaksikan dengan ekstrak, akanterjadi perubahan warna. Pada konsentrasi antioksidan (ekstrak) yang lemah, perubahan yang terjadi adalah memudarnya warna. Semakin adanya penambahan sampel. Apabila DPPH direduksi maka ditunjukkan dengan warna kuning karena adanya aktivitas antioksidan. Semakin besar kemampuan menghambat radikal bebas, maka semakin besar antioksidannya, maka penurunan absorban menjadi dasar perhitungan persentase inhibisi. Senyawa fenol ini mempunyai kemampuan untuk menyumbangkan atom hidrogen, sehingga radikal DPPH dapat tereduksi menjadi bentuk yang lebih stabil. Selain itu, kandungan senyawa saponin yang terdapat pada daun lengkuas yang terdiri dari sapogenin yaitu, senyawa yang mempunyai efek antioksidan dengan Penentuan kandungan total fenol pada ekstrak daun kelompok 1 (ekstrak kental dan fraksi daun manggis) dengan persamaan asam galat Y = 0,002 x + 0,252 (R 2 = 0,944) menunjukkan bahwa senyawa golongan fenol tertinggi terkandung pada fraksi air dan ekstrak etanol. Hal ini dapat terjadi karena senyawa golongan fenol bersifat polar atau semi polar. Flavonoid yang merupakan golongan terbesar dari senyawa golongan fenol bersifat polar sehingga akan banyak terdapat pada fraksi Gambar 1.Reaksi Folin -Fenol tinggi konsentrasi antioksidan atau ekstrak yang direaksikan, warna semakin pudar. air dan ekstrak etanol. Sementara, pada ekstrak n-heksan dimungkikan banyak terdapat aglikon flavonoid yang bersifat kurang polar. Dari gambar 1dan 2 terlihat bahwa semakin tinggi nilai total fenol yang terkandung, maka semakin kecil nilai IC- 50. Nilai IC-50 menunjukkan pada konsentrasi berapa suatu antioksidan dapat Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 279

meredam 50% aktifitas radikal bebas. Semakin kecil nilai IC-50, maka semakin 40 30 20 10 0 total fenol daun kelompok 1 35.69 32.71 27.56 fraksi air eks.total fr. Etil asetat 6.71 fr. N- heksan 200 150 100 50 0 besar kemampuan ekstrak tersebut sebagai antioksidan. Nilai IC-50 ekstrak daun kelompok 1 63.42 66.72 84.4 fraksi air eks.total fr. Etil asetat 188.25 fr. N- heksan Gambar 2.Grafik Kandungan fenol eksrak 1 Gambar 3. Grafik nilai IC-50 ekstrak 1 nilai total fenol ekstrak daun kelompok 2 nilai IC-50 ekstrak daun kelompok 2 20 15 10 14.99 12.7 11.025 200 150 100 80.68 126.59 174.38 5 50 0 lengkuas kunyit kencur 0 lengkuas kunyit kencur Gambar 4. Grafik kandungan fenol ekstrak 2 Gambar 5. Grafik NIlai IC-50 ekstrak 2 kurva korelasi kandungan fenol-aktifitas antioksidan ekstrak-1 aktifitas antioksidan IC-50 y = -4.4902x + 215.95 R² = 0.9874 kandungan fenol total, mg/g sampel Gambar 6. Kurva korelasi kandungan fenol dan aktifitas antioksidan ekstrak 1 Pada ekstrak kelompok 2, yaitu ekstrak dari daun-daun yang berbau khas, persamaan garis untuk asam galat adalah Y= 0,008x + 0,170 dan (r²) 0,995. Ekstrak lengkuas Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 280

memiliki kandungan fenol tertinggi, dan nilai IC-50 terendah. Ekstrak kencur memiliki kandungan fenol terendah dan nilai IC-50 tertinggi. aktifitas antioksidan IC-50 kurva korelasi kandungan fenol-aktifitas antioksidan ekstrak-2 y = -23.419x + 429.44 R² = 0.9899 kandungan fenol total, mg/g sampel Gambar 7. Kurva korelasi kandungan fenol dan aktifitas antioksidan ekstrak 1 Dari gambar 6 dan 7 diatas, terlihat bahwa ada hubungan yang erat antara kandungan total fenol dengan aktifitas antioksidan, KESIMPULAN Semakin tinggi fenol yang terkandung dalam suatu ekstrak tanaman, maka nilai IC-50 nya semakin kecil, kemampuan ekstrak tanaman tersebut sebagai antioksidan semakin besar. diberikan oleh nilai persen korelasi yang mendekati angka 1 pada kedua pengujian. Terdapat hubungan yang signifikan dan berlawanan antara kandungan total fenol dengan nilai IC-50. Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 281

DAFTAR PUSTAKA Dewi, H.O., Ni Made Puspawati, I Made Dira Swantara, I. A.R.Astiti Asih, & Wiwik Susana Rita. 2014. Aktivitas Antioksidan Senyawa Flavonoid Etanol Biji Terong Belanda (Solanium betaceum Syin) dalam menghambat Reaksi Peroksidasi Lemak pada Plasma Darah Tikus Wistar. Jurnal Cakra Kimia, volume 2 : 2302-7274 Hardiana, Riki. 2012. Aktivitas Antioksidan Senyawa Golongan Fenol dari Beberapa Jenis Tumbuhan Famili Malvaceae. Fakultas MIPA Universitas Tanjung Pura. Kurniati, Ruth Indah. 2013. Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etanol Daun Buas- buas (Premma cordifolia Linn.) dengan Metode DPPH (2,2- difenl-1-pikridihidrazil), Skripsi. Universitas Tanjungpura Pontianak. Miryanti, Arry. 2011. Ekstraksi Antioksidan dari Kulit Buah Manggis. Bandung Molyneux, P. 2003. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. Vol.26: 211-219. Winarsi,Hery. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Kinisius Seminar Nasional Farmasi (SNIFA) UNJANI 282