BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1. Alat-alat Erlenmeyer 250 ml Neraca Analitik Inkubator Inkubator Goyang Lemari Es Rotary Evaporator Pyrex Tettler Toledo Memmert E-Scientific Labs Panasonic Steward Cawan Petri - Jarum Ose - Kertas Saring Whatmann No.14 - Pipet Tetes - Spektrofotometer UV-Vis Kamera Blender Shimadzu Sony Lux Botol Aquadest - Gelas Ukur 50 ml Pyrex Batang Pengaduk - Sentrifugasi Iwaki Kapas -
Autoklaf Tabung Reaksi Sturdy Pyrex Penjepit Tabung - Kertas Putih - Gunting - Penggaris - Pinset - Oven Binder Spatula - Pipet Ukur Pyrex Jangka Sorong - Spectrofotometer Serapan Atom 3100 Perkin Elmer 3.2. Bahan-bahan Biji Pepaya Bangkok - Daun Pepaya - Isolat Propionibacterium acnes - Aquadest - Etanol 98% NaCl 0,85 % Teknis p.a Merck Media Agar - Larutan Mac Farland NaCl p.a Merck p.a Merck
Nutrien Substrat - Buffer Phosfat ph 7,0 p.a Merck 3.3. Prosedur Percobaan 3.3.1. Ekstraksi Biji Pepaya (Carica papaya L. ) Dipisahkan biji buah pepaya varietas bangkok dari bagian buah lainnya, kemudian dicuci dibawah air mengalir, ditiriskan dan dikeringkan. Biji buah pepaya kering dipisahkan dari pengotor-pengotornya lalu dihaluskan. Serbuk biji pepaya ditimbang sebanyak 500 gram, lalu dimaserasi dengan pelarut etanol 98% sebanyak 2 liter selama 3 hari (72 jam) sambil diaduk. Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatmann no.14 lalu filtrat yang didapat ditampung kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator hingga didapat ekstrak etanol biji pepaya. 3.3.2. Ekstraksi Daun Pepaya (Carica papaya L.) Dipisahkan daun pepaya dari tulang daunnya, kemudian dicuci dibawah air mengalir, ditiriskan dan dikeringkan. Daun pepaya kering dihaluskan dan ditimbang sebanyak 500 mg, lalu dimaserasi dengan pelarut etanol 98% sebanyak 2 liter selama 3 hari (72 jam) sambil diaduk. Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatmann no.14 lalu filtrat yang didapat ditampung kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator hingga didapat ekstrak etanol daun pepaya.
3.3.3. Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya (Carica papaya L.) Konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya divariasikan menggunakan pelarut aquadest steril. Konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya dibuat dalam 6 ml. 3.3.3.1. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 5% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya 5% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 0,3 ml ekstrak etanol biji pepaya kedalam 5,7 ml aquadest steril. 3.3.3.2. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 25% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya 25% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 1,5 ml ekstrak etanol biji pepaya kedalam 4,5 ml aquadest steril. 3.3.3.3. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 50% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya 50% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 3 ml ekstrak etanol biji pepaya kedalam 3 ml aquadest steril. 3.3.3.4. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 75% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya 75% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 4,5 ml ekstrak etanol biji pepaya kedalam 1,5 ml aquadest steril.
3.3.3.5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 100% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya 100% sebanyak 6 ml yaitu dengan mengambil 6 ml ekstrak etanol biji pepaya tanpa dilarutkan dengan aquadest steril. 3.3.4. Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Pepaya (Carica papaya L.) Konsentrasi ekstrak etanol daun pepaya divariasikan menggunakan pelarut aquadest steril. Konsentrasi ekstrak etanol daun pepaya dibuat dalam 6 ml. 3.3.4.1. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Pepaya 5% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun pepaya 5% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 0,3 ml ekstrak etanol daun pepaya kedalam 5,7 ml aquadest steril. 3.3.4.2. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Pepaya 25% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun pepaya 25% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 1,5 ml ekstrak etanol daun pepaya kedalam 4,5 ml aquadest steril. 3.3.4.3. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Pepaya 50% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun pepaya 50% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 3 ml ekstrak etanol daun pepaya kedalam 3 ml aquadest steril.
3.3.4.4. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Pepaya 75% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun pepaya 75% sebanyak 6 ml yaitu dengan melarutkan 4,5 ml ekstrak etanol daun pepaya kedalam 1,5 ml aquadest steril. 3.3.4.5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Pepaya 100% Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol daun pepaya 100% sebanyak 6 ml yaitu dengan mengambil 6 ml ekstrak etanol daun pepaya tanpa dilarutkan dengan aquadest steril. 3.3.5. Persiapan Pengujian Aktivitas Antibakteri 3.3.5.1. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA) Medium Nutrient Agar (NA) dibuat dengan komposisi sebagai berikut : nutrien substrat berupa ekstrak beef dan pepton masing-masing 10 gram, NaCl 5 gram dan agar 15 gram. Ditimbang stok sesuai kebutuhan dimasukan kedalam erlenmeyer kemudian ditambahkan aquadest sebanyak 1000 ml dan dipanaskan sampai mendidih kemudian mulut tabung disumbat dengan kapas, lalu ditutup dengan kertas. Disterilkan ke dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Setelah keluar dari autoklaf dibiarkan dingin ± 45 o C kemudian dituang pada cawan petri masing-masing ±20 ml lalu dibiarkan dingin. 3.3.5.2. Sterilisasi Alat Cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, penjepit, spatula, media Agar, dan seluruh alat dan bahan (kecuali ekstrak) yang akan digunakan dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas. Kemudian disterilisasi di dalam
autoclave selama 30 menit dengan mengatur tekanan sebesar 15 dyne/cm 3 (1 atm) dan suhu sebesar 121 o C. 3.3.5.3. Pembuatan Suspensi Bakteri Propionibacterium acnes Biakan Propionibacterium acnes diambil menggunakan jarum ose, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan garam fisiologis (NaCl) 0,85% lalu dibandingkan kekeruhannya dengan larutan Standar Mac Farland 0,5 (1,5 10 8 CFU/ml) dengan latar belakang kertas putih, apabila suspensi bakteri kurang keruh ditambah koloni sedangkan apabila lebih keruh ditambah NaCl Fisiologis 0,85%. 3.3.5.4. Inokulasi Bakteri Propionibacterium acnes Kapas ulas steril dicelupkan kedalam suspensi bakteri uji, kemudian diputar beberapa kali dan ditekan ke dinding tabung diatas cairan untuk menghilangkan inokulum yang berlebihan. Selanjutnya kapas tersebut dioleskan ke permukaan media Nutrient Agar (NA) dalam cawan petri sebanyak dua kali yaitu secara horizontal dan vertikal agar pertumbuhan bakteri merata. Media Nutrient Agar (NA) yang telah dipulas dengan suspensi bakteri tersebut dibiarkan diatas meja selama 5-15 menit supaya suspensi bakteri berdifusi kedalam Agar. Media tersebut lalu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 o C selama 24 jam. 3.3.5.5. Pembuatan Cakram Kertas Diambil kertas whatmann no.14 lalu dibuat 10 buah cakram kertas berukuran 6 mm untuk 10 sampel ekstrak daun dan biji pepaya konsentrasi 5%, 25%, 50%, 75% dan 100%. Tiap-tiap cakram kertas kosong sebelumnya dipanaskan dalam oven pada suhu 70 o C selama 15 menit.
3.3.6. Uji Aktivitas Antibakteri Metode Cakram Kertas (Kirby-Bauer) Cakram kertas direndam di dalam sampel ekstrak etanol biji dan daun pepaya yang sudah dibuat dengan berbagai konsentrasi, sampai cakram kertas tidak bisa lagi meresap dalam larutan selama 15 menit. Kemudian ditiriskan sampai tidak ada larutan yang menetes. Masing-masing cakram kertas tersebut diletakkan pada media Nutrient Agar (NA) dalam cawan petri yang telah dipulas dengan suspensi bakteri menggunakan pinset steril. Cawan petri kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 o C. Setelah diinkubasi, diamati dan diukur lebar daerah hambat dari zona terang yang terbentuk di sekeliling cakram kertas menggunakan jangka sorong. 3.3.7. Analisa Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Biji dan Daun Pepaya (Carica papaya L.) Terhadap Propionibacterium acnes Analisa pengaruh pemberian ekstrak etanol daun dan biji pepaya dilakukan terhadap sampel dengan nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) terendah. Nilai KHM dinyatakan sebagai konsentrasi terendah ekstrak etanol daun dan biji pepaya yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Dari data zona hambat pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes, diperoleh KHM terendah pada sampel ekstrak etanol biji pepaya konsentrasi 25% dengan zona hambat sebesar 8,18 mm. 3.3.7.1. Analisa Asam Nukleat dan Protein Suspensi bakteri Propinibacterium acnes yang telah diinkubasi selama 18 jam dalam media Nutrient broth diambil sebanyak 10 ml. Sentrifuse dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Kemudian filtrat dibuang dan pellet dalam tabung dicuci dengan buffer phospat ph 7,0 sebanyak 2 kali. Pellet disuspensikan ke dalam larutan buffer phospat lalu ditambahkan sampel ekstrak etanol biji pepaya 25% dengan dosis 1 KHM, 2 KHM dan kontrol (tanpa larutan sampel) hingga 10
ml. Diinkubasi selama 18-24 jam dalam inkubator goyang 150 rpm. Suspensi kemudian disentrifuse kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm, dan diambil cairan supernatan. Selanjutnya absorbansi diukur dengan Spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. 3.3.7.2. Analisa Ion Logam Analisa ion logam yang diukur adalah dalam bentuk ion K + dan Ca 2+ yang berasal dari sel bakteri akibat perlakuan dengan ekstrak etanol biji pepaya 25%. Sampel untuk analisa ion logam berupa supernatan yang berasal dari perlakuan analisa asam nukleat dan protein. Supernatan dianalisa dengan menggunakan Atomic Absoption Spectroscopy (AAS) Perkin Elmer.
3.4 Bagan Percobaan 3.4.1. Bagan Ekstraksi Biji Pepaya (Carica papaya L.) Biji Pepaya Dicuci dibawah air mengalir Dikeringkan Dipisahkan dari zat pengotor Dihaluskan Serbuk Biji Pepaya Ditimbang 500 gram Dimaserasi menggunakan etanol sebanyak 2 liter selama 3 hari (72 jam) sambil diaduk Disaring menggunakan kertas saring Whatmann no.14 Filtrat Endapan Dipekatkan dengan rotary evaporator Ekstrak etanol biji pepaya
3.4.2. Bagan Ekstraksi Daun Pepaya (Carica papaya L.) Daun Pepaya Dipisahkan dari tulang daun Dicuci dibawah air mengalir Dikeringkan Dihaluskan Serbuk Daun Pepaya Ditimbang 500 gram Dimaserasi menggunakan etanol sebanyak 2 liter selama 3 hari (72 jam) sambil diaduk Disaring menggunakan kertas saring Whatmann no.14 Filtrat Endapan Dipekatkan dengan rotary evaporator Ekstrak etanol daun pepaya
3.4.3. Bagan Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya Ekstrak Etanol Biji Pepaya Aquadest Diukur sebanyak 0,3 ml Dimasukkan ke dalam wadah Diaduk hingga homogen Diukur sebanyak 5,7 ml 6 ml Ekstrak etanol biji pepaya 5 % Dilakukan prosedur yang sama untuk pembuatan variasi konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100% ekstrak etanol biji pepaya 6 ml. 1. Diganti dengan 1,5 ml ekstrak etanol biji pepaya dan 4,5 ml aquadest untuk konsentrasi 25% ekstrak etanol biji pepaya 6 ml. 2. Diganti dengan 3 ml ekstrak etanol biji pepaya dan 3 ml aquadest untuk konsentrasi 50% ekstrak etanol biji pepaya 6 ml. 3. Diganti dengan 4,5 ml ekstrak etanol biji pepaya dan 1,5 ml aquadest untuk konsentrasi 75% ekstrak etanol biji pepaya 6 ml. 4. Diganti dengan 6 ml ekstrak etanol biji pepaya tanpa aquadest untuk konsentrasi 100% ekstrak etanol biji pepaya 6 ml.
3.4.4. Bagan Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Pepaya Ekstrak Etanol Daun Pepaya Aquadest Diukur sebanyak 0,3 ml Dimasukkan ke dalam wadah Diaduk hingga homogen Diukur sebanyak 5,7 ml 6 ml Ekstrak etanol daun pepaya 5 % Dilakukan prosedur yang sama untuk pembuatan variasi konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100% ekstrak etanol daun pepaya 6 ml. 1. Diganti dengan 1,5 ml ekstrak etanol daun pepaya dan 4,5 ml aquadest untuk konsentrasi 25% ekstrak etanol daun pepaya 6 ml. 2. Diganti dengan 3 ml ekstrak etanol daun pepaya dan 3 ml aquadest untuk konsentrasi 50% ekstrak etanol daun pepaya 6 ml. 3. Diganti dengan 4,5 ml ekstrak etanol daun pepaya dan 1,5 ml aquadest untuk konsentrasi 75% ekstrak etanol daun pepaya 6 ml. 4. Diganti dengan 6 ml ekstrak etanol daun pepaya tanpa aquadest untuk konsentrasi 100% ekstrak etanol daun pepaya 6 ml.
3.4.5. Bagan Persiapan Uji Aktivitas Antibakteri 3.4.5.1. Bagan Pembuatan Media Nutrient Agar (NA) Natrium Klorida Agar Nutrient Substrat Ditimbang Ditimbang Ditimbang sebanyak 5 gram sebanyak 15 gram sebanyak 20 gram Dimasukkan kedalam erlenmeyer Ditambahkan aquadest 1000 ml Dipanaskan hingga mendidih Disumbat mulut erlenmeyer dengan kapas lalu ditutup dengan kertas Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Dikeluarkan dari autoklaf Dibiarkan dingin hingga suhu ± 45 o C Dituang pada cawan petri sebanyak ± 20 ml Media Nutrient Agar (NA)
3.4.5.2. Bagan Sterilisasi Alat Peralatan Uji Antibakteri Dicuci bersih Dikeringkan Dibungkus dengan kertas Disterilisasi di dalam autoclave selama 30 menit dengan mengatur tekanan sebesar 15 dyne/cm 3 (1 atm) dan suhu sebesar 121 o C Hasil 3.4.5.3. Bagan Pembuatan Suspensi Bakteri Propionibacterium acnes Biakan Propionibacterium acnes ` Diambil menggunakan jarum ose Dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan garam fisiologis (NaCl) 0,85% Dibandingkan kekeruhannya dengan larutan Standar Mac Farland 0,5 (1,5 10 8 CFU/ml) dengan latar belakang kertas putih Suspensi Bakteri Propionibacterium acnes
3.4.5.4. Bagan Inokulasi Bakteri Propionibacterium acnes Kapas Ulas Steril Dicelupkan kedalam suspensi bakteri Propionibacterium acnes Diputar beberapa kali dan ditekan ke dinding tabung diatas cairan untuk menghilangkan inokulum yang berlebihan Dioleskan kapas ke permukaan media Nutrient Agar (NA) dalam cawan petri secara horizontal dan vertikal Dibiarkan diatas meja selama 5-15 menit supaya suspensi bakteri berdifusi kedalam agar Diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 o C selama 24 jam Hasil 3.4.5.5. Bagan Pembuatan Cakram Kertas Kertas Saring Whatmann No.14 Hasil Diukur masing-masing 6 mm Digunting Dipanaskan dalam oven pada suhu 70 o C selama 15 menit.
3.4.6. Bagan Uji Aktivitas Antibakteri Metode Cakram Kertas (Kirby-Bauer) Cakram Kertas Direndam di dalam sampel ekstrak etanol biji dan daun pepaya yang sudah dibuat dengan berbagai konsentrasi selama 15 menit Ditiriskan sampai tidak ada larutan yang menetes Diletakkan pada media Nutrient Agar (NA) dalam cawan petri yang telah dipulas dengan suspensi bakteri menggunakan pinset steril Diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 o C Diamati dan diukur lebar daerah hambat dari zona terang yang terbentuk di sekeliling cakram kertas menggunakan jangka sorong Hasil
3.4.7. Bagan Analisa Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Biji dan Daun Pepaya (Carica papaya L.) Terhadap Propionibacterium acnes 3.4.7.1. Bagan Analisa Asam Nukleat dan Protein Suspensi Bakteri Propionibacterium acnes Diinkubasi selama 18 jam dalam media Nutient broth Diambil sebanyak 10 ml Disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit Disaring Pellet Filtrat Dicuci dengan buffer phospat ph 7,0 sebanyak 2 kali Disuspensikan ke dalam larutan buffer phospat Ditambahkan sampel ekstrak etanol biji pepaya 25% dengan dosis 1 KHM hingga 10 ml Diinkubasi selama 18-24 jam dalam inkubator goyang 150 rpm Disentrifuse kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm Diambil cairan supernatan Diukur dengan Spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm Hasil - Dilakukan prosedur yang sama untuk sampel ekstrak etanol biji pepaya 25% dengan dosis 2 KHM. - Dilakukan prosedur yang sama untuk larutan blanko (tanpa larutan sampel).
3.4.7.2. Bagan Analisa Ion Logam Supernatan Hasil Analisa Asam Nukleat dan Protein Dianalisis dengan menggunakan Atomic Absoption Spectroscopy (AAS) Perkin Elmer. Hasil
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian 4.1.1. Uji Aktivitas Antibakteri Metode Cakram Kertas (Kirby-Bauer) 4.1.1.1 Data Hasil Pengukuran Zona Hambat Dari hasil pengujian aktivitas antibakteri sampel berupa ekstrak etanol daun dan biji pepaya (Carica papaya L.), didapat hasil pengukuran zona hambat yang terbentuk pada media Nutrient Agar (NA) untuk masing-masing sampel disajikan pada tabel 4.1 di bawah ini : Tabel 4.1 Data Hasil Pengukuran Zona Hambat Ekstrak Etanol Biji dan Daun Pepaya (Carica papaya L.) Konsentrasi Ekstrak Zona Hambat Ekstrak Etanol Daun Pepaya (mm) Zona Hambat Ekstrak Etanol Biji Pepaya (mm) 5 % 0 0 25 % 0 8,18 50 % 8,30 8,20 75 % 8,35 12,18 100 % 12, 28 12, 30 Penentuan diameter zona hambat dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar yaitu dengan cara melihat zona bening dan mengukur diameter zona bening tersebut menggunakan jangka sorong. Zona bening yang terbentuk pada media Nutrient Agar (NA) yang telah diberikan ekstrak etanol daun dan biji
pepaya (Carica papaya L.) sebagai bahan antibakteri dapat dilihat pada gambar 4.1 dan 4.2 berikut : Gambar 4.1. Zona Hambat Ekstrak Etanol Daun Pepaya Gambar 4.2 Zona Hambat Ekstrak Etanol Biji Pepaya
4.1.2. Analisa Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun dan Biji Pepaya Terhadap Propionibacterium acnes Analisa pengaruh pemberian ekstrak etanol daun dan biji pepaya dilakukan terhadap sampel dengan nilai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) terendah. Nilai KHM dinyatakan sebagai konsentrasi terendah ekstrak etanol daun dan biji pepaya yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Dari data zona hambat pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes, diperoleh KHM terendah pada sampel ekstrak etanol biji pepaya konsentrasi 25% dengan zona hambat sebesar 8,18 mm. 4.1.2.1. Data Analisa Asam Nukleat dan Protein Data hasil pengukuran absorbansi suspensi bakteri Propionibacterium acnes yang diberikan sampel ekstrak etanol biji pepaya konsentrasi 25% sebagai KHM terendah dengan menggunakan spektrofotometri UV pada panjang gelombang (λ) 260 nm dan 280 nm dapat dilihat pada tabel dibawah ini : Tabel 4.2 Data Hasil Pengukuran Absorbansi Suspensi Bakteri PA + Ekstrak Etanol Biji Pepaya (Carica papaya L.) 25% Absorbansi Perlakuan Panjang Gelombang (λ) 260nm Panjang Gelombang (λ) 280nm Blanko 0,512 0,406 1 KHM 2,601 2,733 2 KHM 2,777 2,809 Nilai 1 KHM yaitu nilai 25% dari ekstrak etanol biji pepaya dari keseluruhan jumlah sampel yaitu 6 ml sehingga didapat nilai 1 KHM yaitu 1,5 ml
ekstrak etanol biji pepaya, kemudian diperoleh pula nilai 2 KHM yaitu 3 ml ekstrak etanol biji pepaya. Sedangkan untuk larutan blanko tidak diberikan ekstrak etanol biji pepaya didalamnya. 4.1.2.2. Data Analisa Ion Logam Data hasil pengukuran konsentrasi ion Ca 2+ dan K + yang terdeteksi dari suspensi bakteri Propionibacterium acnes yang ditambahkan sampel ekstrak etanol biji pepaya konsentrasi 25% sebagai KHM terendah dengan menggunakan spektrofotometri serapan atom dapat dilihat pada tabel 4.3 dibawah ini : Tabel 4.3 Data Hasil Pengukuran Konsentrasi Ion Ca 2+ dan Ion K + Perlakuan Konsentrasi (ppm) Ion Ca 2+ Ion K + Blanko 3,1882 1416, 0349 1 KHM 35,2013 3141,0004 2 KHM 47,3885 8964,1591 4.2. Pembahasan Salah satu tanaman obat Indonesia yang telah banyak dikenal khasiat dan kegunaannya adalah pepaya (Carica papaya L). Pemanfaatan tanaman pepaya sebagai pengobatan tradisional ini disebabkan adanya sejumlah senyawa pada bagian-bagian tanaman tersebut yang memiliki berbagai khasiat, salah satu yang telah banyak dibuktikan adalah khasiatnya sebagai bahan antibakteri. Pada bagian bijinya, senyawa yang diduga berpotensi sebagai antibakteri adalah alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin (Taufiq dkk, 2015). Daun pepaya yang masih segar juga diketahui banyak menghasilkan getah berwarna putih yang mengandung
enzim pemecah protein atau proteolitik yang disebut enzim papain, enzim ini diketahui ampuh untuk menghambat laju pertumbuhan berbagai jenis bakteri. Pada penelitian ini telah dilakukan ekstraksi daun dan biji pepaya, pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun dan biji pepaya, serta analisa pengaruh pemberian ekstrak sampel dengan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) terendah terhadap bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri penyebab jerawat, Propionibacterium acnes. Pembuatan ekstrak daun dan biji pepaya (Carica papaya L.) dilakukan dengan menggunakan metode maserasi. Maserasi adalah pengekstrakan simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan pada temperatur ruang (kamar) dengan penggantian pelarut beberapa kali sampai agak jernih. Metode maserasi digunakan karena memiliki keuntungan yaitu menggunakan peralatan sederhana, efisien dalam segi waktu, dan baik untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan terhadap panas. Pelarut yang digunakan adalah etanol 98%, karena merupakan pelarut yang bersifat polar, universal dan mudah didapat serta merupakan pelarut yang sering digunakan pada saat melakukan ekstraksi. Maserasi dilakukan selama 72 jam, kemudian seluruh filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotari evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Pengujian antibakteri ekstrak daun dan biji pepaya dilakukan dengan metode difusi cakram kertas (Kirby-Bauer) menggunakan media Nutrient Agar (NA). Ekstak etanol daun dan biji pepaya dibuat dalam variasi konsentrasi 5%, 25%, 50%, 75% dan 100%. Data dan gambar hasil zona hambat dapat terlihat pada tabel 4.1 serta gambar 4.1 dan gambar 4.2. Menurut Rosyidah dkk (2010), zona bening di sekitar disk menunjukkan adanya aktivitas antibakteri. Luas zona bening tersebut sangat dipengaruhi oleh daya antibakteri sampel ekstrak yang diberikan. Klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakteri berdasarkan diameter zona bening terdiri atas 4 kelompok yaitu respon lemah (diameter 5 mm), sedang
(diameter 5-10 mm), kuat (diameter 10-20 mm), dan sangat kuat (diameter 20 mm). Berdasarkan klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakteri, maka sampel ekstrak etanol daun pepaya dan biji pepaya dapat diklasifikasikan memiliki respon yang sedang hingga kuat dalam menghambat pertumbuhan Propionibacterium acnes. Hasil zona hambat pada tabel 4.1 juga menunjukkan, semakin tinggi konsentrasi, semakin besar zona hambat yang terbentuk di sekeliling kertas cakram. Hal ini sesuai dengan pernyataan Pelczar dan Chan (1988), bahwa semakin tinggi konsentrasi suatu bahan antibakteri maka aktivitas antibakterinya semakin kuat. Menurut Roslizawaty dkk (2013), meningkatnya konsentrasi zat menyebabkan meningkatnya kandungan senyawa aktif yang berfungsi sebagai antibakteri, sehingga kemampuan dalam membunuh suatu bakteri juga semakin besar. Hasil ini dapat terlihat pada gambar 4.3 di bawah ini : Zona Hambat (mm) 14 12 10 8 6 4 Zona Hambat Ekstrak Etanol Daun Pepaya (mm) Zona Hambat Ekstrak Etanol Biji Pepaya (mm) 2 0 5% 25% 50% 75% 100% Konsentrasi Ekstrak Gambar 4.3 Histogram Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun dan Biji Pepaya
Konsentrasi mikrobia pada permukaan medium juga memengaruhi ukuran zona hambat. Semakin tinggi konsentrasi mikrobia maka zona penghambatan akan semakin kecil. Faktor lain yang juga memengaruhi ukuran zona hambat adalah volume medium pada cawan petri. Semakin besar jumlah volume medium yang dituang pada petri tentunya mengakibatkan semakin tebal medium pada petri. Semakin besar jumlah volume medium pada petri maka zona hambat akan semakin kecil karena wilayah yang harus dijangkau juga semakin besar. Hasil analisis fitokimia pada daun pepaya (Carica papaya L.) yang dilakukan A yun dan Layla (2015) menunjukkan bahwa daun pepaya (Carica papaya L.) positif mengandung alkaloid, triterpenoid, steroid, flavonoid, saponin, dan tanin. Sedangkan pada analisis fitokimia yang dilakukan Taufiq dkk (2015) menunjukkan bahwa biji pepaya hitam mengandung alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin. Sehingga pemberian ekstrak daun dan biji pepaya yang mengandung senyawa-senyawa antibakteri tersebut diduga dapat menyebabkan mempengaruhi permeabilitas sel bakteri Propionibacterium acnes. Menurut Pelczar dan Chan (1988), untuk dapat membunuh mikroorganisme, sampel uji harus masuk ke dalam sel melalui dinding sel. Struktur dinding sel bakteri dapat menentukan penetrasi dari suatu zat, ikatan dan aktivitas senyawa antibakteri. Bakteri Propionibacterium acnes merupakan bakteri gram positif yang memiliki struktur dinding sel dengan lebih banyak peptidoglikan, sedikit lipid dan mengandung polisakarida (asam teikoat). Asam teikoat merupakan polimer yang larut dalam air, yang berfungsi sebagai transpor ion positif untuk keluar masuk zat. Sifat larut air inilah yang menunjukkan bahwa dinding sel bakteri gram positif lebih bersifat polar (Sudewi dan Lolo, 2016). Ekstrak sampel yang digunakan berupa daun dan biji pepaya mengandung senyawa flavonoid yang bersifat polar sehingga lebih mudah menembus lapisan peptidoglikan yang bersifat polar pada dinding sel bakteri. Sedangkan senyawa terpenoid yang juga terdapat dalam ekstrak daun dan biji papaya mudah larut dalam lapisan lipid sel bakteri yang bersifat nonpolar.
Secara umum struktur sel bakteri terdiri dari kapsul sebagai lapisan terluar pelindung dinding sel, dinding sel yang tersusun dari peptidoglikan sebagai pelindung bentuk sel serta membran sitoplasma yang tersusun dari senyawa fosfolipid dan protein berfungsi sebagai pembungkus sitoplasma yang mengandung molekul organik seperti lemak, protein, karbohidrat, dan garamgaram mineral, enzim, DNA, klorosom (pada bakteri fotosintetik), dan ribosom dan mengatur pertukaran zat yang berada di dalam sel dengan zat yang ada diluar sel. Ion Ca 2+ pada bakteri berfungsi menjaga kestabilan dinding sel, sedangkan kestabilan permeabilitas membran sel bakteri juga dipengaruhi oleh konsentrasi ion K + pada cairan sitoplasma. Membran sitoplasma berperan dalam mempertahankan keutuhan struktur sel dan berfungsi dalam transport nutrient secara selektif ke dalam sel, juga tempat melekatnya enzim-enzim yang terlibat dalam biosintesis dinding sel. Bila membran tersebut rusak, maka fungsi sel terganggu yang mengakibatkan pertumbuhan sel terhambat ataupun mati (Miksusanti et al, 2008). Berdasarkan hasil analisa menggunakan spektrofotometer uv-vis pada suspensi bakteri Propionibacterium acnes yang telah diberikan eksrak etanol biji pepaya 25%, menunjukkan data nilai absorbansi yang cukup tinggi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Menurut Miksusanti, et al (2008), senyawasenyawa yang memberikan serapan pada panjang gelombang 260 nm adalah RNA dan DNA, sedangkan senyawa yang memberikan serapan pada panjang gelombang 280 nm adalah protein. Dari terdeteksinya asam nukleat dan protein melalui analisa spektrofotometer uv-vis tersebut, dapat diduga bahwa sel bakteri mengalami kerusakan membran sel sehingga menyebabkan terhambatnya pertumbuhan serta kematian sel. Meningkatnya nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm seiring meningkatnya konsentrasi ekstrak etanol biji pepaya 25% yang diberikan dapat terlihat pada gambar 4.4 berikut :
3 2,5 Absorbansi 2 1,5 1 Absorbansi Panjang Gelombang 260 nm Absorbansi Panjang Gelombang 280 nm 0,5 0 Kontrol 1 KHM 2 KHM Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 25% Gambar 4.4 Histogram Absorbansi Asam Nukleat (260 nm) dan Protein (280 nm) Pemberian ekstrak etanol biji pepaya 25% yang mengandung senyawa golongan fenol seperti flavonoid dan alkaloid pada konsentrasi KHM, juga dapat diduga mengakibatkan keluarnya ion-ion logam yang berada di dalam sitoplasma khususnya ion kalium (K + ) dan kalsium (Ca 2+ ). Substansi fenol dalam konsentrasi tinggi akan mengkoagulasi protein dalam sel. Sedangkan dalam kosentrasi rendah, mengakibatkan bocornya isi sitoplasma (Pelczar dan Chan, 1988). Terdeteksinya isi sitoplasma pada sel Propionibacterium acnes khususnya ion K + dan Ca 2+ melalui analisa menggunakan spectrophotometer serapan atom dapat terlihat pada tabel 4.3 dan peningkatan konsentrasi K + dan Ca 2+ di luar sel seiring meningkatnya konsentrasi ekstrak biji etanol pepaya 25% yang diberikan dapat terlihat pada gambar 4.5 dan 4.6 berikut :
Konsentrasi ion Ca 2+ (ppm) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Kontrol 1 KHM 2 KHM Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 25% Gambar 4.5 Histogram Konsentrasi Ion Ca 2+ Konsentrasi Ion K + (ppm) 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Kontrol 1 KHM 2 KHM Konsentrasi Ekstrak Etanol Biji Pepaya 25% Gambar 4.6 Histogram Konsentrasi Ion K +
Peningkatan konsentrasi Ca 2+ dan K + di luar menunjukkan meningkatnya perubahan permeabilitas membran sel bakteri. Ion Ca 2+ berperan untuk menjaga kestabilan dinding bakteri, sehingga dengan keluarnya ion tersebut dari sel, maka kestabilan dinding sel akan terganggu dan selanjutnya akan menyebabkan terhambatnya pertumbuhan bakteri yang berujung pada kematian sel (Suliantari, 2009).
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan sebagai berikut: 1. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak etanol daun dan biji pepaya, maka semakin tinggi daya hambatnya terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes. 2. Ekstrak etanol biji pepaya lebih baik daya hambatnya terhadap P.acnes dibandingkan ekstrak etanol daun pepaya dikarenakan mampu menghasilkan zona hambat mulai dari konsentrasi 25% yaitu sebesar 8, 18mm. Sedangkan ekstrak etanol daun pepaya mampu menghasilkan zona hambat dimulai dari konsentrasi 50%. 3. Ekstrak etanol biji dan daun pepaya (Carica papaya L.) diduga mampu mempengaruhi permeabilitas sel bakteri Propionibacterium acnes yang ditandai dengan terdeteksinya asam nukleat, protein serta ion logam (K + dan Ca 2+ ) dari sel P.acnes yang telah diberikan ekstrak etanol biji papaya 25%. 5.2 Saran 1. Sebaiknya dilakukan penelitian untuk memisahkan masing-masing senyawa yang terkandung pada daun dan biji pepaya untuk dapat menentukan aktivitas antibakteri dari masing-masing senyawa tersebut. 2. Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai kemampuan ekstrak daun dan biji pepaya apabila diaplikasikan sebagai sabun ataupun masker anti jerawat.