METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-Oktober 2011 di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih, Laboratorium Kromatografi dan Analisis Tumbuhan, Departemen Agronomi dan Hortikultura serta Laboratorium Kimia Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, IPB Darmaga. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan antara lain benih padi yang terdiri atas lima varietas padi gogo yaitu Situ Patenggang, Limboto, Inpago 4, Inpago 5, dan Inpago 6, dan 26 galur padi gogo yang berasal dari Balai Besar Penelitian Tanaman Padi Instalasi Muara, Bogor. Deskripsi varietas dapat dilihat pada Lampiran 1-5. Bahan lainnya adalah etanol 96% untuk pengusangan benih; aquabidest untuk pengukuran daya hantar listrik dan kebocoran metabolisme; natrium fosfat, reagent A, reagent B, reagent C dan standar BSA untuk pengukuran kebocoran protein; reagent anthrone dan larutan standar glukosa untuk pengukuran kebocoran total gula; larutan pengestrak (PA), larutan PB, larutan pewarna (PC) untuk pengukuran kebocoran fosfor; tissue towel sebagai media perkecambahan; kantong strimin sebagai wadah benih selama pengusangan dan kertas label. Peralatan yang digunakan adalah alat pengusangan cepat fisik tipe 1-800- 284-5779, alat pengusangan cepat kimiawi (wadah plastik kedap udara berbentuk silinder dengan tinggi 27 cm dan diameter 27 cm), conductivity meter, spektrofotometer, box pengecambahan (17.5 cm x 10.5 cm x 7.5 cm), oven, desikator, timbangan, dan handsprayer. Metode Penelitian Kegiatan penelitian ini terdiri atas dua percobaan yaitu : (1) Penetapan metode pengusangan cepat untuk mengidentifikasi vigor daya simpan padi gogo; dan (2) Deteksi vigor daya simpan 26 galur padi gogo.
12 Percobaan 1 Penetapan Metode Pengusangan Cepat untuk Mengidentifikasi Vigor Daya Simpan Padi Gogo Percobaan ini dilakukan untuk menetapkan satu metode pengusangan cepat dari tiga metode pengusangan cepat, yang sederhana dan sesuai digunakan untuk mengidentifikasi vigor daya simpan padi gogo. Ketiga metode pengusangan cepat yang dilakukan adalah : Pengusangan Cepat Fisik Rancangan yang digunakan pada percobaan ini adalah rancangan kelompok lengkap teracak (RKLT) faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama terdiri atas pengusangan cepat fisik (suhu 43-45 o C, RH 100%) selama 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 dan 120 jam, dan lima varietas padi gogo yaitu Situ Patenggang, Limboto, Inpago 4, Inpago 5, dan Inpago 6 sebagai faktor kedua. Kombinasi dari kedua faktor menghasilkan 55 perlakuan dan setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga diperoleh 165 satuan percobaan dengan setiap ulangan terdiri atas 50 butir benih. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji F, perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap variabel yang diamati akan diuji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada selang kepercayaan 95% (Gomez & Gomez 1995). dimana : Model linear yang digunakan adalah: Y ijk = µ + K i + α j + β k + α j β k + ε ijk Y ijk = nilai pengamatan pada pengusangan fisik ke-j, varietas ke-k, dan kelompok ke-i µ = nilai tengah pengamatan K i = pengaruh kelompok ke-i (i = 1, 2, 3) α j = pengaruh pengusangan fisik ke-j (j = 0, 12,... 120 jam) β k = pengaruh perlakuan varietas ke-k (k = 1, 2,... 5) α j β k = pengaruh interaksi perlakuan pengusangan fisik ke-j dan varietas ke-k ε ij = pengaruh galat percobaan ke-ijk
13 Penguapan dengan Etanol 96% Rancangan yang digunakan pada percobaan ini adalah rancangan kelompok lengkap teracak (RKLT) faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama terdiri atas pengusangan dengan uap etanol selama 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, dan 200 menit, dan lima varietas padi gogo yaitu Situ Patenggang, Limboto, Inpago 4, Inpago 5, dan Inpago 6 sebagai faktor kedua. Kombinasi dari kedua faktor menghasilkan 55 perlakuan dan setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga diperoleh 165 satuan percobaan dengan setiap ulangan terdiri atas 50 butir benih. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji F, perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap variabel yang diamati akan diuji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada selang kepercayaan 95% (Gomez & Gomez 1995). Model linear yang digunakan adalah: Y ijk = µ + K i + α j + β k + α j β k + ε ijk dimana : Y ijk = nilai pengamatan pada penguapan dengan etanol ke-j, varietas ke-k, dan kelompok ke-i µ = nilai tengah pengamatan K i = pengaruh kelompok ke-i (i = 1, 2, 3) α j = pengaruh penguapan dengan etanol ke-j (j = 0, 20,... 200 menit) β k = pengaruh perlakuan varietas ke-k (k = 1, 2,... 5) α j β k = pengaruh interaksi perlakuan penguapan dengan etanol ke-j dan varietas ke-k ε ij = pengaruh galat percobaan ke-ijk Perendaman dalam Etanol 96% Rancangan yang digunakan pada percobaan ini adalah rancangan kelompok lengkap teracak (RKLT) faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama terdiri atas pengusangan dengan perendaman dalam etanol selama 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, dan 20 menit, dan lima varietas padi gogo yaitu Situ Patenggang, Limboto, Inpago 4, Inpago 5, dan Inpago 6 sebagai faktor kedua. Kombinasi dari kedua faktor menghasilkan 55 perlakuan dan setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga diperoleh 165 satuan percobaan dengan setiap ulangan terdiri atas 50 butir benih. Data yang
14 diperoleh dianalisis menggunakan uji F, perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap variabel yang diamati akan diuji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada selang kepercayaan 95% (Gomez & Gomez 1995). dimana : Model linear yang digunakan adalah: Y ijk = µ + K i + α j + β k + α j β k + ε ijk Y ijk = nilai pengamatan pada perendaman dalam etanol ke-j, varietas ke-k, dan kelompok ke-i µ = nilai tengah pengamatan K i = pengaruh kelompok ke-i (i = 1, 2, 3) α j = pengaruh perendaman dalam etanol ke-j (j = 0, 2,... 20 menit) β k = pengaruh perlakuan varietas ke-k (k = 1, 2,... 5) α j β k = pengaruh interaksi perlakuan perendaman dalam etanol ke-j dan varietas ε ij ke-k = pengaruh galat percobaan ke-ijk Metode pengusangan yang dipilih adalah metode pengusangan yang memiliki nilai R 2 tertinggi dari analisi regresi data rata-rata daya berkecambah. Waktu pengusangan yang digunakan adalah waktu pengusangan dimana daya berkecambah mencapai 80%. Hal ini disesuaikan dengan persyaratan sertifikasi benih bina tanaman pangan, dimana daya berkecambah minimal benih padi sebesar 80% (Deptan 2009). Pengaruh Metode Pengusangan Cepat Terpilih (Perendaman dalam Larutan Etanol) Terhadap Mutu Fisiologi dan Fisikokimiawi Benih Metode pengusangan yang terpilih, sebelum diaplikasikan pada percobaan kedua yaitu terhadap 26 galur padi gogo, juga dilakukan terhadap kelima varietas yang digunakan pada percobaan pertama dengan tujuan untuk melihat perubahan fisikokimiawi. Rancangan yang digunakan pada percobaan ini adalah faktorial rancangan acak lengkap (RAL) dengan dua faktor. Faktor pertama pecelupan dalam etanol 96% selama 0 menit dan 3 menit 24 detik dan faktor kedua yaitu lima varietas padi gogo yaitu Situ Patenggang, Limboto, Inpago 4, Inpago 5, dan Inpago 6. Setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga diperoleh 30 satuan percobaan. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji F, perlakuan yang menunjukkan pengaruh yang
15 nyata terhadap variabel yang diamati akan diuji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada selang kepercayaan 95% (Gomez & Gomez 1995). Model linear untuk percobaan ini adalah : Y ijk = µ + α j + β k + α j β k + ε ijk dimana : Y ijk = nilai pengamatan pada perendaman dalam etanol ke-j, varietas ke-k, dan ulangan ke-i µ = nilai tengah pengamatan α j = pengaruh perendaman dalam etanol ke-j (j = 0 menit dan 3 menit 24 detik) β k = pengaruh perlakuan varietas ke-k (k = 1, 2,... 5) α j β k = pengaruh interaksi perlakuan perendaman dalam etanol ke-j dan varietas ke-k ε ij = pengaruh galat percobaan ke-ijk Percobaan 2 Deteksi Vigor Daya Simpan 26 Galur Padi Gogo Percobaan ini dilakukan untuk mendeteksi vigor daya simpan 26 galur padi gogo menggunakan rancangan kelompok lengkap teracak (RKLT) dengan dua faktor yaitu galur padi gogo dan perendaman dalam etanol 96%. Deteksi vigor dilakukan dengan metode terpilih yaitu dengan merendam galur padi gogo ke dalam etanol 96% selama 0 menit dan 3 menit 24 detik. Setiap perlakuan terdiri atas 50 butir benih dan diulang sebanyak 3 kali. Data yang diperoleh akan diuji dengan uji F, dimana apabila menunjukkan pengaruh nyata akan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada selang kepercayaan 95% (Gomez & Gomez 1995). Model linear yang digunakan adalah: Y ijk = µ + K i + α j + β k + α j β k + ε ijk dimana : Y ijk = nilai pengamatan pada perendaman dalam etanol ke-j, varietas ke-k, dan kelompok ke-i µ = nilai tengah pengamatan K i = pengaruh kelompok ke-i (i = 1, 2, 3) α j = pengaruh perendaman dalam etanol ke-j (j = 0 menit dan 3 menit 24 detik)
16 β k = pengaruh perlakuan galur ke-k (k = 1, 2,... 26) α j β k = pengaruh interaksi perlakuan perendaman dalam etanol ke-j dan galur ke-k ε ij = pengaruh galat percobaan ke-ijk Pelaksanaan Penelitian Percobaan 1 Penetapan Metode Pengusangan Cepat untuk Mengidentifikasi Vigor Daya Simpan Padi Gogo Pengusangan cepat fisik Masing-masing varietas benih padi gogo dikemas dalam kantong strimin kemudian dimasukkan ke dalam alat pengusangan cepat fisik pada suhu 43-45 o C, RH 100% selama 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, dan 120 jam. Benih yang telah diusangkan selanjutnya dikecambahkan menggunakan metode Uji Di atas Kertas (UDK) yaitu menanam benih 50 butir dalam box pengecambahan yang telah diisi dengan empat lembar kertas towel yang telah dibasahkan kemudian dikecambahkan pada suhu ruang. Variabel yang diamati adalah daya berkecambah, indeks vigor, kecepatan tumbuh, dan laju pertumbuhan kecambah. Penguapan dengan Etanol 96% Masing-masing varietas benih padi gogo dikemas dalam kantong strimin kemudian dimasukkan ke dalam box pengusangan yaitu wadah plastik berbentuk silinder dengan diameter 27 cm dan tinggi 27 cm, di dalamnya terdapat tiga gelas kaca yang masing-masing berisi 300 ml etanol 96%. Kawat kasa diletakkan di atas gelas sebagai tempat meletakkan benih. Benih kemudian diuapi etanol selama 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, dan 200 menit. Benih yang telah mendapat perlakuan penguapan dengan etanol 96% selanjutnya dikecambahkan menggunakan metode UDK dan diletakkan pada suhu ruang. Variabel yang diamati adalah daya berkecambah, indeks vigor, kecepatan tumbuh, dan laju pertumbuhan kecambah. Perendaman dalam Etanol 96% Masing-masing varietas padi gogo dimasukkan dalam kantong strimin kemudian direndam dalam etanol. Lamanya perendaman adalah 0, 2, 4, 6, 8, 10,
17 12, 14, 16, 18, dan 20 menit. Benih yang telah direndam dalam etanol 96% kemudian dikeringanginkan, selanjutnya dikecambahkan menggunakan metode UDK dan diletakkan pada suhu ruang. Variabel yang diamati adalah daya berkecambah, indeks vigor, kecepatan tumbuh, dan laju pertumbuhan kecambah. Pengaruh Metode Pengusangan Cepat Terpilih (Perendaman dalam Larutan Etanol) Terhadap Mutu Fisiologi dan Fisikokimiawi Benih Metode yang dipilih selain diaplikasikan pada percobaan kedua yaitu terhadap 26 galur padi gogo, juga dilakukan terhadap kelima varietas yang digunakan pada percobaan pertama. Masing-masing varietas padi gogo dimasukkan dalam kantong strimin kemudian direndam dalam etanol selama 0 menit dan 3 menit 24 detik, kemudian dikeringanginkan, selanjutnya dikecambahkan menggunakan metode UDK dan diletakkan pada suhu ruang. Variabel yang diamati adalah daya berkecambah dan kecepatan tumbuh. Perubahan fisikokimiawi diamati melalui uji daya hantar listrik dan kebocoran hasil metabolisme meliputi kebocoran protein, kebocoran total gula dan kebocoran fosfor. Percobaan 2 Deteksi Vigor Daya Simpan 26 Galur Padi Gogo Pada percobaan ini 26 galur padi gogo diusangkan berdasarkan metode yang terpilih yaitu direndam dalam larutan etanol 96% selama 3 menit 24 detik. Benih yang telah direndam dalam etanol 96% selanjutnya ditanam dengan metode UDK dan dikecambahkan pada suhu ruang. Variabel yang diamati adalah daya berkecambah, delta daya berkecambah (selisih antara daya berkecambah kontrol dan perlakuan), kecepatan tumbuh benih, dan delta kecepatan tumbuh (selisih antara kecepatan tumbuh kontrol dan perlakuan). Variabel yang diamati adalah : Pengamatan Daya Berkecambah (DB) Pengamatan dilakukan terhadap kecambah normal pada hari kelima dan ketujuh. Daya berkecambah dihitung dengan rumus :
18 KN I = Jumlah kecambah normal pada hari kelima setelah dikecambahkan KN II = Jumlah kecambah normal pada hari ketujuh setelah dikecambahkan Indeks Vigor (IV) Indeks vigor dinilai berdasarkan persentase kecambah normal yang muncul pada pengamatan hitungan pertama (hari ke-5). Kecepatan Tumbuh (K CT ) Pengamatan dilakukan setiap hari terhadap persentase kecambah normal dibagi dengan etmal. Nilai etmal kumulatif dimulai saat benih ditanam sampai dengan waktu pengamatan dan dihitung dengan rumus penentuan kecepatan tumbuh (Sadjad et al. 1999). K CT = kecepatan tumbuh N = persentase kecambah normal t = etmal (jumlah jam dari saat tanam dibagi 24 jam) t n = waktu akhir pengamatan Laju Pertumbuhan Kecambah (LPK) Laju pertumbuhan kecambah dihitung dengan menggunakan rumus :
19 LPK = laju pertumbuhan kecambah BKKN = jumlah berat kering kecambah normal KN = jumlah kecambah normal Daya Hantar Listrik (DHL) Pengukuran daya hantar listrik (µmhos/cm/g) dilakukan dengan cara mengukur air rendaman dari 100 butir benih padi dalam 50 ml aquabidest dalam wadah yang ditutup rapat selama 24 jam pada suhu 20 o C. Selain itu juga disiapkan blangko, yaitu 50 ml aquabidest tanpa benih yang juga diletakkan dalam wadah yang ditutup rapat selama 24 jam. Air rendaman diukur daya hantar listriknya dengan conductivity meter. Hasil pengukuran tersebut dibagi dengan berat benih. Daya hantar listrik diukur dengan menggunakan rumus: Kebocoran Protein Benih sebanyak 100 butir direndam dalam 50 ml aquabidest selama 24 jam pada suhu 20 0 C. Benih yang direndam kemudian dipisahkan dari air rendamannya. Air rendaman benih kemudian dianalisis kandungan proteinnya menggunakan metode Lowry. Air rendaman benih sebanyak 1 ml ditambahkan dengan 0.9 ml reagent A (1.97 g garam rochelle, 85.85 g Na 2 CO 3, dan 500 ml NaOH 1 N yang dilarutkan dalam aquadest hingga volumenya mencapai 1 liter) kemudian dikocok dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 50 o C. Setelah itu didinginkan kemudian ditambahkan 0.10 ml reagent B (19.76 g garam rochelle, 9.99 g CuSO 4.5H 2 O, dan 10 ml NaOH yang dilarutkan dalam aguadest hingga volumenya menjadi 100 ml), kemudian dikocok dan diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. Larutan kemudian ditambahkan dengan 3 ml reagent C (1 ml Folin- Ciocalteau yang dilarutkan dengan 15 ml aquadest) kemudian dikocok dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 50 o C. Larutan kemudian didinginkan, kemudian diukur absorbannya pada panjang gelombang 650 nm menggunakan spektrofotometer.
20 A = protein dalam air rendaman benih B = volume air rendaman benih W = berat benih fp = faktor pengenceran Kebocoran Total Gula Benih sebanyak 100 butir direndam dalam 50 ml aquabidest selama 24 jam pada suhu 20 0 C. Benih yang direndam kemudian dipisahkan dari air rendamannya. Total gula air rendaman benih dianalisis menggunakan metode anthrone. Air rendaman benih 1 ml ditambah dengan reagent anthrone sebanyak 4 ml, kemudian dipanaskan selama 8 menit. Setelah larutan dingin, dibaca absorbannya pada panjang gelombang 630 nm menggunakan spektofotometer. A = total gula dalam air rendaman benih B = volume air rendaman benih W = berat benih fp = faktor pengenceran Kebocoran Fosfor Benih sebanyak 100 butir direndam dalam aquabidest selama 24 jam pada suhu 20 0 C. Benih yang direndam kemudian dipisahkan dari air rendamannya. Kandungan fosfor air rendaman benih dianalisis menggunakan metode kalorimetri. Air rendaman benih sebanyak 5 ml dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 5 ml larutan PB dan 5 tetes laruran pereduksi PC lalu dikocok. Setelah tercampur, didiamkan selama 15 menit, kemudian dibaca absorbannya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm.
21 A = fosfor dalam air rendaman benih B = volume air rendaman benih W = berat benih fp = faktor pengenceran