BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang disusun secara faktorial dianalisis menggunakan metode diskriptif kuantitatif. Setiap perlakuan dilakukan dengan 3 kali ulangan, pengamatan dilakukan tiap hari mulai hari ke-0, sampai hari ke-6, dengan rincian sebagai berikut: Faktor Pertama : Konsentrasi perasan rimpang kunyit (F) 0%. 1%, 3%, 5%, 7%, dan 9%. F 1 = Variasi konsentrasi perasan rimpang kunyit 0% F 2 = Variasi konsentrasi perasan rimpang kunyit 1% F 3 = Variasi konsentrasi perasan rimpang kunyit 3% F 4 = Variasi konsentrasi perasan rimpang kunyit 5% F 5 = Variasi konsentrasi perasan rimpang kunyit 7% F 6 = Variasi konsentrasi perasan rimpang kunyit 9% Faktor Kedua : Lama Perendaman (P) yang terdiri dari 6 hari P 1 = Lama perendaman 1 hari (24 jam) P 2 = Lama perendaman 2 hari (48 jam) P 3 = Lama perendaman 3 hari (72 jam) P 4 = Lama perendaman 4 hari (96 jam) P 5 = Lama perendaman 5 hari (120 jam) P 6 = Lama perendaman 6 hari (144 jam)
Dari kedua faktor tesebut dapat diperoleh kombinasikan sebagai berikut: F 1 P 1 F 1 P 2 F 1 P 3 F 1 P 4 F 1 P 5 F 1 P 6 = Variasi konsentrasi 0% dengan lama perendaman 1 hari = Variasi konsentrasi 1% dengan lama perendaman 1 hari = Variasi konsentrasi 3% dengan lama perendaman 1 hari = Variasi konsentrasi 5% dengan lama perendaman 1 hari = Variasi konsentrasi 7% dengan lama perendaman 1 hari = Variasi konsentrasi 9% dengan lama perendaman 1 hari F 2 P 1 F 2 P 2 F 2 P 3 F 2 P 4 F 2 P 5 F 2 P 6 = Variasi konsentrasi 0% dengan lama perendaman 2 hari = Variasi konsentrasi 1% dengan lama perendaman 2 hari = Variasi konsentrasi 3% dengan lama perendaman 2 hari = Variasi konsentrasi 5% dengan lama perendaman 2 hari = Variasi konsentrasi 7% dengan lama perendaman 2 hari = Variasi konsentrasi 9% dengan lama perendaman 2 hari F 3 P 1 F 3 P 2 F 3 P 3 F 3 P 4 F 3 P 5 F 3 P 6 = Variasi konsentrasi 0% dengan lama perendaman 3 hari = Variasi konsentrasi 1% dengan lama perendaman 3 hari = Variasi konsentrasi 3% dengan lama perendaman 3 hari = Variasi konsentrasi 5% dengan lama perendaman 3 hari = Variasi konsentrasi 7% dengan lama perendaman 3 hari = Variasi konsentrasi 9% dengan lama perendaman 3 hari F 4 P 1 F 4 P 2 F 4 P 3 = Variasi konsentrasi 0% dengan lama perendaman 4 hari = Variasi konsentrasi 1% dengan lama perendaman 4 hari = Variasi konsentrasi 3% dengan lama perendaman 4 hari
F 4 P 4 F 4 P 5 F 4 P 6 = Variasi konsentrasi 5% dengan lama perendaman 4 hari = Variasi konsentrasi 7% dengan lama perendaman 4 hari = Variasi konsentrasi 9% dengan lama perendaman 4 hari F 5 P 1 F 5 P 2 F 5 P 3 F 5 P 4 F 5 P 5 F 5 P 6 = Variasi konsentrasi 0% dengan lama perendaman 5 hari = Variasi konsentrasi 1% dengan lama perendaman 5 hari = Variasi konsentrasi 3% dengan lama perendaman 5 hari = Variasi konsentrasi 5% dengan lama perendaman 5 hari = Variasi konsentrasi 7% dengan lama perendaman 5 hari = Variasi konsentrasi 9% dengan lama perendaman 5 hari F 6 P 1 F 6 P 2 F 6 P 3 F 6 P 4 F 6 P 5 F 6 P 6 = Variasi konsentrasi 0% dengan lama perendaman 6 hari = Variasi konsentrasi 1% dengan lama perendaman 6 hari = Variasi konsentrasi 3% dengan lama perendaman 6 hari = Variasi konsentrasi 5% dengan lama perendaman 6 hari = Variasi konsentrasi 7% dengan lama perendaman 6 hari = Variasi konsentrasi 9% dengan lama perendaman 6 hari 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Fisiologi Hewan Universitas Islam Negeri (UIN) Malang, pada bulan Juli s/d Agustus 2008.
3.3 Variabel Penelitian Variabel adalah perilaku atau karakteristik yang memberikan nilai beda terhadap suatu (benda, manusia, dll) ciri yang dimiliki oleh suatu anggota atau kelompok (Notoadmodjo, 2005). Variabel yang digunakan dalam penelitian ini dibedakan menjadi tiga bagian yaitu: 1. Varibel Bebas Variabel yang sengaja dibuat berbeda-beda dalam satu percobaan yaitu : a. Konsentrasi rimpang kunyit masing-masing: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, dan 9%, dan b. Lama perendaman 1 hari (24 jam), 2 hari (48 jam), 3 hari (72 jam), 4 hari (96 jam), 5 hari (120 jam), 6 hari (144 jam). 2. Variabel Terikat Variabel terikat, merupakan variabel yang terjadi karena perlakuan variabel bebas yaitu E. coli dan Salmonella. 3. Variabel Terkontrol Variabel terkontrol, merupakan variabel yang dibuat sama dalam suatu penelitian, yang meliputi: sterilisasi, suhu, media. 3.4 Alat dan Bahan Penelitian 3.4.1 Alat-Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: - blender - cawan petri - pisau - gelas ukur - gelas ukur 10/100 - sikat pencuci
- rak tabung reaksi - jarum ose - labu ukur - mikro-pipet - tabung reaksi - vortex - sendok - alumunium foil - jarum spet - gelas arloji - elemenyer 250/500 ml - lampu spiritus - beaker gelas - timbangan analitik - kaca pengaduk - oven - termometer ruang - autoglave - gelas aquades - inkubator 3.4.2 Bahan-Bahan - Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: - Tahu segar (UKM tahu Guyup Rukun Lowokwaru, Kelurahan Kendalsari, kecamatan Lowokwaru, Kota Malang). - Rimpang kunyit (diperoleh dari pasar Dinoyo). - Nutrien Agar (NA), Lactose Broth (LB) (diperoleh dari Laboratorium Mikro-Biologi UIN Malang), untuk medium E. coli. - Salmonella Singgela Agar (SS-Agar) (diperoleh dari Laboratorium Biologi UMM Malang), untuk medium Salmonella. - Aquades, kain kasa, alkohol 70%, kapas (diperoleh dari Laboratorium PANADIA Coorporation, Malang). - Kertas label, tissue, plastik bungkus, karet (diperoleh dari Sardo Swalayan, Malang).
3.5 Cara Kerja Penelitian 3.5.1 Sterilisasi Sterelisasi dalam mikroorganisme berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun (Irianto, 2006). Sterilisasi alat yang akan digunakan sebelum semua peralatan digunakan yaitu dengan cara membungkus semua peralatan menggunakan kertas, kemudian dimasukkan kedalama plastik, seperti cawan petri, tabung reaksi, lalu dimasukkan ke dalam autoclave pada suhu 121 o C dengan tekanan 15 psc (per square inci) selam kurang lebih 15 menit. Untuk alat yang tidak tahan panas tinggi disterilisasi dengan zat kimia berupa alkohol 70% (Utami, 2004). 3.5.2 Preparasi Rimpang Kunyit a. Mempersiapan bahan dan alat pembuatan perasan rimpang kunyit, seperti: blander, pisau, rimpang kunyit dan aquades steril. b. Rimpang kunyit dikupas, dipotong-potong kemudian dicuci dengan air mengalir dan dihaluskan dengan cara di blender. c. Kemudian diperas dan disaring dengan alat saring / kertas saring Kunyit 150 gram Dikupas dan dicuci Diblender Disaring Ampas Perasan Kunyi Gambar 3. 1 Diagram Alir Proses Pembuatan Perasan Rimpang Kunyit
3.5.3 Pengujian Perasan Rimpang Kunyit Terhadap Bakteri Uji a. Pengambilan konsentrasi perasan kunyit 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, dan 9%. b. Dimasukkan tahu ke dalam gelas aqua, dengan ukuran (2 x 4 x 6 cm), yang telah terisi air perlakuan sebanyak 140 ml. c. Ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet gelang. d. Diinkubasi pada suhu ruang (27 o C) e. Pengamatan diamati tiap hari, mulai hari ke-0 sampai hari ke 6, dan f. Dilakukan penumbuhan bakteri E. coli (NA) dan Salmonella (LB SS-Agar). Tahu Konsentrasi Kunyit: 1%, 3%, 5%, 7%, 9% Aquades dalam wadah gelas aqua 140 ml 1 potong tahu ukuran 2 x 4 x 6 cm Dimasukkan kedalam waskom (tahu terendam seluruhnya dalam larutan pengawet) Diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu ruang (27 o C) Analisa* Total E. coli dan Salmonella Keterangan: * analisa dilakukan setiap hari selama 6 hari, dimulai pada hari ke-0. Gambar 3.2 Diagram Alir Proses Perlakuan (pengawetan) Terhadap Bakteri Uji.
3.5.4 Penumbuhan Bakteri E. coli (metode tuang / pour plat ) a. Menimbang sampel tahu yang dilakukan perlakuan (25 gram). b. Dimasukkan kedalam blander yang ditambahkan aquades steril 175 ml. c. Diblander selama 5 menit (tahu berubah menjadi bubur). d. Diambil sampel dengan mikro-pipet steril (1 ml). e. Dilakukan pengencera terhadap sampel caranya ialah: pengenceran 10-1, 10-2 diperoleh dengan memasukkan 1 ml sampel kedalam 9 ml aquades steril. f. Kemudian di vortex (agar homogen). g. Diinokulasikan sebanyak 1 ml hasil pengenceran kedalam cawan petri kemudian media NA dituangkan. h. Diratakan dengan cara memutar-mutar cawan diatas meja sebanyak 5 kali. i. Diinkubasi pada suhu 35 o C selama 1 x 24 jam. j. Mengamati koloni yang tumbuh, dan menghitung jumlahnya. Perhitungan yang dianggap benar hanya pada cawan yang terdapat 30-300 cfu. k. Dihitung total mikroba/ml sampel dengan rumus: Jumlah koloni X 1/pengenceran (cfu)
25 gr tahu Di encerkan pada aquades 175 ml Diambil 1 ml Di encerkan pada aquades steril 1 ml Ditumbuhkan pada mediun NA (tuang) Diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 35 o C Penghitungan total bakteri E. coli Gambar 3.3 Diagram Alir Penghitungan Bakteri E. Coli 3.5.5 Penumbuhan Bakteri Salmonella (metode tuang / pour plat ) a. Menimbang sampel tahu yang dilakukan perlakuan (25 gram). b. Dimasukkan kedalam blander yang ditambahkan aquades steril 175 ml. c. Diblander selama 5 menit (tahu berubah menjadi bubur). d. Diambil sampel dengan mikro-pipet steril (1 ml). e. Dilakukan pengenceran terhadap sampel yaitu: pengenceran 10-1, 10-2 diperoleh dengan memasukkan 1 ml sampel kedalam 9 ml ke media LB. f. Kemudian diinkubasi pada suhu 35 o C selama 1 x 24 jam. g. Ditumbuhkan kedalam cawan petri Dengan media SS-Agar.
h. Diinkubasi pada suhu 35 o C selama 2 x 24 jam. i. Dihitung total bakteri salmonella. Sampel Tahu Di encerkan pada aquades 175 ml Diambil 1 ml Ditumbuhkan pada medium LB Diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 35 o C Diambil 1 ml Ditumbuhkan pada medium SS-Agar Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 35 o C Total bakteri Salmonella Gambar 3.4 Skematis isolasi dan Penumbuhan Bakteri Salmonella
3.6 Pengamatan Pengamatan yang dilakukan terdapat beberapa tahap yaitu: 1. Pengamatan mikrobiologi meliputi: a. Uji pendahuluan b. Total bakteri E. coli (cfu), dan c. Salmonella 3.7 Analisa Data Analisis kualitas dari perendaman tahu dengan bahan pengawet perasan rimpang kunyit dapat diketahui dengan total bakteri dengan metode cawan. Data hasil pengamatan dianalisa dengan menggunakan ANAVA (Tabel Analisa Ragam) yang diolah dengan menggunakan SPSS. Hasil uji menunjukkan adanya pengaruh, maka dilakukan uji lanjut Uji Jarak Duncan (UJD).