III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini berlangsung selama 20 bulan yaitu dari bulan April 2006 sampai Desember 2007. Penelitian dilakukan di Laboratorium Teknologi Bioindustri (LTB) Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPP Teknologi), kawasan Pusat Penelitian Ilmu Pengetahuan dan Teknologi (PUSPIPTEK) Serpong, Tangerang. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain : Isolat Lactobacillus acidophilus FNCC 116 (Koleksi Kultur Mikroba Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Gadjah Mada Yogyakarta) dan Bacillus licheniformis F11.1 atau Bacillus licheniformis F11 ( pga) (Koleksi Kultur Mikroba Laboratorium Bioindustri, BPP Teknologi). Kulit udang vannamei (Penaeus vannamei) diperoleh dari pabrik pembekuan udang PT Wirontono Baru, Jakarta Utara. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah glukosa, ekstrak khamir, pepton, NaCl, MgCl 2. 7H 2 O, CaCl 2.2H 2 O, NaOH, Azokasein, Tri Chloro Acetic acid (TCA), Bovine Serum Albumin (BSA), dan de Man Rogosa Sharpe (MRS) Broth. Alat yang digunakan yaitu bioreaktor ukuran 2 dan 13 liter, otoklaf, tabung reaksi, pembakar bunsen, cawan petri, cawan porselin, sentrifuse Hitachi Nimac CR 21G, corong, ph-meter Knick, spektrofotometer Novaspec II, erlenmeyer, beaker glass, alat pengering ultra violet, tanur, High performance liquid chromatography (HPLC), injektor, inkubator shaker, eppendorf, gelas ukur, dan lain-lain.
3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan melalui serangkaian tahapan percobaan sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 7. A Penentuan kecepatan agitasi pada proses demineralisasi kulit udang Tujuan percobaan adalah untuk menentukan kecepatan agitasi yang sesuai untuk proses demineralisasi. Selain itu untuk mengkarakterisasi proses demineralisasi selama fermentasi pada berbagai kecepatan agitasi. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari tiga perlakuan kecepatan agitasi yaitu 0 rpm, 50 rpm dan 100 rpm. Setiap perlakuan diulang sebanyak dua kali dan pengujian contoh dilakukan duplo. Prosedur percobaan dilakukan sebagai berikut : Kulit udang yang diperoleh dari pabrik pembekuan udang PT Wirontono Baru - Jakarta Utara, dicuci bersih kemudian dilakukan pengecilan ukuran, setelah itu disaring dengan kawat saringan ukuran 0,5 1 cm. Selanjutnya ditimbang sebanyak 300 gram dan dikemas dalam kantong plastik untuk disimpan dalam freezer pada suhu -20 o C sampai siap digunakan dalam proses fermentasi. Langkah berikutnya adalah pembuatan starter dan inokulum bakteri L. acidophilus FNCC116 berdasarkan prosedur Jung et al. (2005) yang dimodifikasi. Pembuatan starter dilakukan dengan mengambil sebanyak 1 ml biakan bakteri L. acidophilus FNCC116 dari stock culture yang disimpan pada suhu -20 o C, kemudian dikulturasi dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 9 ml larutan MRS (deman Ragosa Sharps). Proses kulturasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 24 jam dalam inkubator.
PERANCANGAN PROSES BIOLOGI EKSTRAKSI KITIN A. Penentuan kecepatan agitasi yang sesuai untuk proses demineralisasi kulit udang C. Ekstraksi kitin dari kulit udang melalui jalur tahapan : - Demineralisasi kemudian dideproteinasi - Deproteinasi kemudian didemineralisasi Jalur tahapan ekstraksi kitin terpilih B. Penentuan kecepatan agitasi dan tingkat aerasi yang sesuai untuk proses deproteinasi kulit udang D. Penentuan sistem fermentasi proses demineralisasi Sistem fermentasi terpilih untuk proses demineralisasi kulit udang E. Optimasi kecepatan agitasi dan tingkat aerasi proses deproteinasi kulit udang hasil demineralisasi Kecepatan agitasi dan tingkat aerasi yang optimal untuk proses deproteinasi kulit hasil demineralisasi F. Penentuan sistem fermentasi proses deproteinasi kulit udang hasil demineralisasi Sistem fermentasi terpilih untuk proses deproteinasi kulit udang hasil demineralisasi Rancangan proses biologi untuk ekstraksi kitin dari kulit udang KRITERIA PENINGKATAN SKALA PROSES BIOLOGI EKSTRAKSI KITIN G. Penentuan kriteria peningkatan skala proses biologi ekstraksi kitin dari kulit udang Kriteria peningkatan skala terbaik Gambar 7 Skematik tahapan penelitian
Selanjutnya, starter bakteri tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang berisi 90 ml larutan MRS. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C sampai diperoleh nilai optical density (OD) 0,85 sebagai inokulum. Lama waktu yang diperlukan untuk mencapai nilai OD 0,85 sekitar 7 8 jam. Tingkat kepadatan sel pada nilai OD 0,85 adalah 1 x 10 9 cfu/ml (Lampiran 10). Kemudian dilakukan proses demineralisasi terhadap kulit udang melalui proses fermentasi asam laktat (Rao dan Steven 2005 yang dimodifikasi). Fermentasi dilakukan dalam bioreaktor ukuran 2 liter dengan volume kerja 1 liter. Proses demineralisasi dilakukan sebagai berikut : dimasukkan 100 ml (10 %, v/v) larutan inokulum dan 300 gram (30 %, b/v) kulit udang ke dalam bioreaktor yang telah diisi medium fermentasi sebanyak 900 ml. Komposisi medium fermentasi tersebut terdiri dari glukosa 60 g/l dan ekstrak khamir 0,5 g/l. ph awal medium fermentasi ditetapkan pada ph 7. Setelah itu difermentasi pada suhu ruang (30 o C ± 1 o C) dan diagitasi sesuai dengan perlakuan yang ditetapkan selama 48 jam. Selama proses fermentasi dilakukan pengamatan terhadap kulit udang dan medium fermentasi. Variabel yang diamati pada kulit udang adalah kandungan abu (AOAC 1984) kemudian dilakukan penghitungan tingkat penurunan kandungan abu kulit udang. Variabel yang diamati pada medium fermentasi adalah kandungan glukosa (metode DNS, AOAC 1984), kandungan asam laktat (HPLC), ph (ph meter), dan jumlah bakteri (TPC). Pengambilan contoh dilakukan setiap 6 jam sekali. Data yang diperoleh dari penghitungan tingkat penurunan kandungan abu dianalisis secara statistik dengan uji F dan uji Jarak Barganda Duncan pada taraf
kepercayaan 95 %. Adapun hasil pengukuran dari parameter yang lain dianalisis secara diskriptif dalam bentuk grafik. B Penentuan kecepatan agitasi dan tingkat aerasi pada proses deproteinasi kulit udang Percobaan ini bertujuan menentukan tingkat aerasi dan kecepatan agitasi yang sesuai untuk proses deproteinasi kulit udang. Selain itu untuk mengkarakterisasi proses deproteinasi selama fermentasi pada perlakuan berbagai tingkat aerasi dan kecepatan agitasi. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap pola faktorial yang terdiri dari dua faktor perlakuan. Faktor perlakuan pertama yaitu tingkat aerasi yang terdiri dari dua taraf yaitu 2,0 vvm dan 2,5 vvm. Faktor kedua adalah kecepatan agitasi yang terdiri dari tiga taraf yaitu 200 rpm, 250 rpm, dan 300 rpm. Kombinasi dari kedua faktor itu dihasilkan 6 kombinasi perlakuan. Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak dua kali dan pengujian contoh dilakukan duplo. Prosedur percobaan terdiri dari dua tahapan. Pertama adalah penyiapan starter dan inokulum B.licheniformis F11.1. Kedua adalah proses deproteinasi kulit udang melalui kultivasi bakteri B.licheniformis F11.1. Penyiapan starter dan inokulum bakteri B.licheniformis F11.1 berdasarkan prosedur Waldeck et al. (2006) yang dimodifikasi. Penyiapan starter dilakukan sebagai berikut : Pertama-tama diambil satu ose bakteri B. licheniformis F11.1 dari cultur stock kemudian dikulturasi dalam erlenmeyer 125 ml yang diisi 20 ml media LB (Luria Broth) steril. Komposisi media LB terdiri dari pepton 10 g/l; ekstrak khamir 5 g/l; NaCl 5 g/l. ph ditetapkan pada 7,3. Setelah itu,
diinkubasi dalam shaker dan diagitasi 180 rpm selama 6 jam pada suhu 55 o C. Penyiapan inokulun adalah sebagai berikut : diambil sebanyak 20 ml dari larutan starter dan dimasukkan ke dalam 180 ml medium LB steril ph 7,3. Kemudian diinkubasi dalam inkubator shaker dan diagitasi 180 rpm. Suhu inkubator dipertahankan 55 o C. Inkubasi dilakukan sampai diperoleh optical density (OD) larutan inokulum 0,9. OD larutan inokulum 0,9 diperkirakan mengandung sel dengan tingkat kepadatan mencapai 1 x 10 9 cfu/ml (Lampiran 9). Selanjutnya dilakukan proses deproteinasi kulit udang melalui proses kultivasi bakteri (Metode Shimahara et al. 1984 yang dimodifikasi). Kultivasi dilakukan dalam bioreaktor ukuran 2 liter dengan volume kerja 1 liter. Proses deproteinasi dilakukan sebagai berikut : dimasukkan 200 ml (20 %, v/v) larutan inokulum dan 300 gram (30 %, b/v) kulit udang ke dalam bioreaktor yang telah diisi medium fermentasi sebanyak 800 ml. Komposisi medium fermentasi terdiri dari ekstrak khamir 5 g/l; KH 2 PO 4 5 g/l; CaCl 2 1 g/l; NaCl 5 g/l dan MgSO 4 0,5 g/l. ph awal medium diatur pada 7,3. Setelah itu diinkubasi selama 60 jam pada suhu 55 o C dan ph selama fermentasi diatur pada kisaran 7,8 8,0. Kemudian diaerasi dan diagitasi sesuai dengan perlakuan yang ditetapkan. Selama proses deproteinasi dilakukan pengamatan terhadap kulit udang dan cairan fermentasi serta penghitungan tingkat pengurangan kandungan protein kulit udang. Variabel yang diamati pada kulit udang adalah kandungan protein (metode Lowry et al. 1954 dimodifikasi). Adapun variabel yang diamati pada cairan fermentasi adalah aktivitas enzim (Azokasein), dan total bakteri (TPC). Pengambilan contoh dilakukan setiap 6 jam sekali.
Data hasil penghitungan tingkat penghilangan kandungan protein kulit udang dianalisis secara statistik dengan uji F dan uji Jarak Berganda Duncan pada taraf kepercayaan 95 %. Sedangkan data hasil pengukuran dari kandungan protein kulit udang, aktivitas enzim, dan total bakteri dianalisis secara diskriptif dalam bentuk grafik. C Penentuan jalur tahapan proses ekstraksi kitin secara biologi Ekstraksi kitin dari kulit udang secara biologi dapat dilakukan melalui dua jalur tahapan. Pertama adalah jalur tahapan proses deproteinasi yang dilanjutkan dengan proses demineralisasi. Kedua adalah jalur tahapan proses demineralisasi yang dilanjutkan dengan proses deproteinasi. Percobaan ini bertujuan mendapatkan jalur tahapan yang lebih baik untuk ekstraksi kitin dari kulit udang secara biologi dari dua tahapan jalur yang berbeda. Selain itu juga untuk mengkarakterisasi proses yang terjadi pada setiap jalur tahapan proses yang dilakukan. Setiap jalur tahapan proses ekstraksi kitin dalam percobaan ini diulang sebanyak dua kali. C1 Prosedur percobaan ekstraksi kitin melalui jalur tahapan proses Deproteinasi yang dilanjutkan dengan proses Demineralisasi Prosedur percobaan untuk jalur tahapan proses deproteinasi yang dilanjutkan dengan proses demineralisasi dilakukan sebagai berikut : Menyiapkan kulit udang sebagaimana dilakukan pada percobaan A sedangkan pembuatan starter dan inokulum B. licheniformis F11.1 dilakukan sebagaimana pada percobaan B. Langkah berikutnya dilakukan proses deproteinasi dalam bioreaktor ukuran 2 liter dengan volume kerja 1 liter. Inokulum bakteri sebanyak 200 ml (20
%, v/v) dan kulit udang sebanyak 300 gram (30 %, b/v) dimasukkan ke dalam bioreaktor. Setelah itu dimasukkan pula larutan medium fermentasi sebanyak 800 ml. Komposisi medium fermentasi terdiri dari ekstrak khamir 5 g/l; KH 2 PO 4 5 g/l; CaCl 2 1 g/l; NaCl 5 g/l dan MgSO 4 0,5 g/l. ph awal medium diatur pada 7,3. Kemudian difermentasi selama 60 jam pada suhu 55 o C. Selama fermentasi diberi aerasi 2,5 vvm dan agitasi 250 rpm (hasil terpilih dari percobaan B). ph medium fermentasi diatur pada kisaran 7,8 8,2. Kulit udang yang telah dideproteinasi ini dicuci bersih dengan air mengalir sampai diperoleh air bekas cucian mempunyai ph 7. Selanjutnya dimasukkan dalam plastik, ditimbang dan disimpan dalam freezer pada suhu -20 o C sampai siap digunakan untuk proses demineralisasi. Langkah berikutnya dilakukan penyiapan proses demineralisasi kulit udang hasil deproteinasi. Penyiapan proses demineralisasi kulit udang hasil deproteinasi dilakukan sebagai berikut : Menyiapkan starter dan inokulum bakteri L. acidophilus FNCC116 sebagaimana yang dilakukan pada percobaan A. Selanjutnya dilakukan proses demineralisasi yang dilakukan dalam bioreaktor ukuran 2 liter dengan volume kerja 1 liter. Larutan inokulum sebanyak 100 ml (10 %, v/v) dan 300 gram (30 %, b/v) kulit udang hasil deproteinasi dimasukkan ke dalam bioreaktor yang telah diisi medium fermentasi sebanyak 900 ml. Komposisi medium fermentasi tersebut terdiri dari glukosa 60 g/l dan ekstrak khamir 0,5 g/l. Kemudian difermentasi pada suhu ruang (30 o C ± 1 o C). Selama fermentasi dilakukan agitasi dengan kecepatan 50 rpm (hasil terpilih dari percobaan A). Fermentasi dilakukan selama 48 jam.
C2 Prosedur percobaan ekstraksi kitin melalui jalur tahapan proses Demineralisasi yang dilanjutkan dengan proses Deproteinasi Prosedur percobaan untuk jalur tahapan proses demineralisasi yang dilanjutkan dengan proses deproteinasi dilakukan sebagai berikut : Menyiapkan kulit udang dan starter serta inokulum L. acidophilus FNCC116 sebagaimana yang dilakukan pada percobaan A. Langkah selanjutnya didemineralisasi dalam bioreaktor 2 liter dengan volume kerja 1 liter. Inokulum sebanyak 100 ml (10 %, v/v) dan 300 gram (30 %, b/v) kulit udang segar dimasukkan ke dalam bioreaktor yang telah diisi medium fermentasi sebanyak 900 ml. Komposisi medium fermentasi tersebut terdiri dari glukosa 60 g/l dan ekstrak khamir 0,5 g/l. Setelah itu difermentasi pada suhu ruang (30 o C ± 1 o C) dan diagitasi dengan kecepatan 50 rpm (hasil terpilih dari percobaan A) selama 48 jam. Selesai fermentasi, kulit udang hasil demineralisasi dicuci bersih dengan air mengalir sampai diperoleh air bekas cucian mempunyai ph 7. Selanjutnya dimasukkan dalam plastik, ditimbang dan disimpan dalam freezer pada suhu -20 o C sampai siap digunakan untuk proses deproteinasi. Langkah berikutnya adalah kulit udang hasil demineralisasi dideproteinasi dengan prosedur sebagai berikut : Menyiapkan starter dan inokulum bakteri B.licheniformis F11.1 sebagaimana yang dilakukan pada percobaan B. Selanjutnya dilakukan proses deproteinasi dalam bioreaktor ukuran 2 liter dengan volume kerja 1 liter. Inokulum bakteri sebanyak 200 ml (20 %, v/v) dan kulit udang hasil demineralisasi sebanyak 300 gram (30 %, b/v) dimasukkan ke dalam bioreaktor yang telah diisi 800 ml medium fermentasi. Komposisi medium terdiri dari
ekstrak khamir 5 g/l; KH 2 PO 4 5 g/l; CaCl 2 1 g/l (b/v); NaCl 5 g/l dan MgSO 4 0,5 g/l. Setelah itu difermentasi selama 60 jam pada suhu 55 o C. Selama fermentasi dilakukan aerasi dan agitasi masing-masing sebesar 2,5 vvm dan 250 rpm (hasil terpilih dari percobaan B) serta ph diatur pada kisaran 7,8 8,0. Pengamatan dilakukan pada kulit udang dan medium fermentasi dari kedua jalur tahapan proses tersebut. Variabel pengamatan pada kulit udang selama proses dilakukan terhadap kandungan abu (AOAC 1984) dan protein (metode Lowry et al. 1954 dimodifikasi). Variabel pengamatan pada medium fermentasi untuk proses deproteinasi dilakukan terhadap total bakteri (TPC) dan aktivitas enzim (Azokasein) sedangkan untuk proses demineralisasi dilakukan terhadap total bakteri (TPC), asam laktat (HPLC), ph (ph meter), dan glukosa (metode DNS, AOAC 1984). Pengambilan contoh dilakukan setiap 12 jam sekali. Data yang diperoleh dianalisis secara diskriptif dalam bentuk grafik. D Penentuan sistem fermentasi proses demineralisasi kulit udang Tujuan percobaan ini adalah mendapatkan sistem fermentasi yang paling baik sehingga diperoleh tingkat penurunan kandungan abu kulit udang maksimal pada proses demineralisasi. Selain itu untuk mengkarakterisasi proses demineralisasi pada berbagai sistem fermentasi yang dicoba. Percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari tiga perlakuan sistem fermentasi yaitu (A) fermentasi batch, (B) fermentasi batch berurutan (subsequent batch) dengan pengantian 100 % medium yang dilakukan pada jam ke 24 jam, (C) fermentasi batch berturut-turut (subsequent batch)
dengan pengantian 50 % medium yang dilakukan pada jam ke 24 jam. Setiap perlakuan sistem fermentasi diulang sebanyak dua kali. Prosedur percobaan dilakukan sebagai berikut : Menyiapkan kulit udang, starter dan inokulum L. acidophilus FNCC116 sebagaimana yang dilakukan pada percobaan A. Langkah selanjutnya yaitu sebanyak 100 ml (10 %, v/v) larutan inokulum dan 300 gram (30 %, b/v) kulit udang segar dimasukkan ke dalam bioreaktor ukuran 2 liter yang telah diisi medium sebanyak 900 ml. Komposisi medium terdiri dari glukosa 60 g/l dan ekstrak khamir 0,5 g/l. Setelah itu difermentasi sesuai dengan perlakuan sistem fermentasi yang ditetapkan. Untuk setiap sistem fermentasi dilakukan pada suhu kamar (30 o C ± 1 o C) dan diagitasi dengan kecepatan yang terbaik berdasarkan percobaan A yaitu 50 rpm. Pengamatan dilakukan terhadap kulit udang dan cairan fermentasi. Variabel yang diamati pada kulit udang adalah kandungan abu (AOAC 1984) dan penghitungan terhadap tingkat penghilangan kandungan abu. Sedangkan pada cairan fermentasi adalah kandungan glukosa (metode DNS, AOAC 1984), kandungan asam laktat (HPLC), ph (ph meter), dan jumlah bakteri (TPC) dalam media fermentasi. Pengambilan contoh dilakukan setiap 6 jam sekali. Data yang diperoleh dari penghitungan tingkat penurunan kandungan abu dianalisis secara statistik dengan uji F dan uji Jarak Barganda Duncan pada taraf kepercayaan 95 %. Adapun hasil pengukuran dari parameter yang lain dianalisis secara diskriptif dalam bentuk grafik. E Optimasi kecepatan agitasi dan tingkat aerasi pada proses deproteinasi kulit udang hasil demineralisasi.
Percobaan ini bertujuan untuk mengoptimasi kecepatan agitasi dan tingkat aerasi pada proses deproteinasi kulit udang hasil demineralisasi terhadap tingkat hidrolisis proteinnya. Metode permukaan respon, dengan rancangan komposit pusat digunakan dalam percobaan ini. Kombinasi perlakuan terdapat dalam Tabel 3. Tabel 3 Kombinasi perlakuan dengan rancangan komposit pusat Variabel Kode X 1 X 2 Aerasi (vvm) Variabel Asli Agitasi (rpm) -1-1 2 200-1 1 2 300 1-1 3 200 1 1 3 300 0 0 2,5 250 0 0 2,5 250 0 0 2,5 250 0 0 2,5 250 0 0 2,5 250-1,414 0 1,8 250 1,414 0 3,2 250 0-1,414 2,5 180 0 1,414 2,5 320 Prosedur percobaan dilakukan sebagai berikut : Kulit udang hasil
demineralisasi dari hasil sistem fermentasi terpilih (percobaan D) ditimbang sebanyak 300 gram (30 %, b/v), kemudian dimasukkan ke dalam bioreaktor ukuran 2 liter. Setelah itu dimasukkan inokulum bakteri sebanyak 200 ml (20 %, v/v) dan medium fermentasi sebanyak 800 ml. Penyiapan inokulum bakteri dan komposisi medium fermentasi dilakukan seperti pada percobaan B. Setelah itu difermentasi selama 72 jam pada suhu 55 o C, dan ph dijaga pada kisaran 7,8 8,2. Selama proses fermentasi diberi aerasi dan agitasi. Tingkat aerasi dan agitasi sesuai dengan perlakuan yang diberikan (Tabel 3). Pengamatan dilakukan terhadap kandungan protein kulit udang pada awal dan akhir proses fermentasi. Selanjutnya dilakukan penghitungan terhadap tingkat hidrolisis protein yaitu kandungan protein awal dikurangi kandungan protein akhir fermentasi dibagi kandungan protein awal dan dikalikan 100 %. Data hasil penghitungan tingkat hidrolisis protein untuk pendugaan model regresi dianalisis dengan program Statistic Analytical System (SAS). Kemudian dibuat grafik optimasi dan kontur respon. F Penentuan sistem fermentasi proses deproteinasi kulit udang hasil demineralisasi Tujuan percobaan ini adalah mendapatkan sistem fermentasi yang paling baik sehingga diperoleh tingkat penurunan kandungan protein kulit udang hasil demineralisasi maksimal pada proses deproteinasi. Selain itu untuk mengkarakterisasi proses deproteinasi pada berbagai sistem fermentasi yang dicoba.
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari empat perlakuan sistem fermentasi yaitu (A) fermentasi batch dengan penambahan inokulum sebanyak 2 kali pada awal fermentasi dan jam ke 24. (B) fermentasi batch dengan penambahan inokulum sebanyak 2 kali pada awal fermentasi dan jam ke 12. (C) fermentasi batch berturut-turut (subsequent batch), dengan penggatian 100 % medium pada jam ke 24. (D) fermentasi batch. Setiap sistem fermentasi yang dicoba diulang sebanyak dua kali. Prosedur percobaan dilakukan sebagai berikut : Kulit udang hasil demineralisasi dari hasil sistem fermentasi terpilih (percobaan D) ditimbang sebanyak 300 gram (30 %, b/v), kemudian dimasukkan ke dalam bioreaktor ukuran 2 liter. Setelah itu dimasukkan inokulum bakteri sebanyak 200 ml (20 %, v/v) dan medium fermentasi sebanyak 800 ml. Penyiapan inokulum bakteri dan komposisi medium fermentasi dilakukan sebagaimana percobaan B. Setelah itu difermentasi sesuai dengan perlakuan sistem fermentasi yang telah ditetapkan. Selama proses fermentasi dari setiap perlakuan, suhu dijaga konstan pada 55 o C, ph diatur pada kisaran 7,8 8,0. Selain itu juga dilakukan aerasi dan agitasi masing-masing 2,3 vvm dan 275 rpm (hasil percobaan E). Pengamatan dilakukan terhadap kulit udang dan medium fermentasi Variabel yang diamati pada kulit udang adalah kandungan abu (AOAC 1984) dan protein (metode Lowry et al. 1951 dimodifikasi) sedangkan pada medium fermentasi adalah aktivitas enzim protease (Azokasein), dan jumlah bakteri (TPC). Pengambilan contoh dilakukan setiap 12 jam sekali. Kemudian kulit udang pada akhir proses dari perlakuan sistem fermentasi terbaik juga diamati
kandungan total nitrogen (metode kyldhal, AOAC 1984) untuk mengetahui kandungan kitinya. Data yang diperoleh dari penghitungan tingkat penurunan kandungan protein dianalisis secara statistik dengan uji F dan uji Jarak Berganda Duncan pada taraf kepercayaan 95 %. Adapun hasil pengukuran dari parameter yang lain dianalisis secara diskriptif dalam bentuk grafik. G Penentuan kriteria peningkatan skala proses biologi ekstraksi kitin dari kulit udang Peningkatan skala dilakukan berdasarkan metode kaidah ibu jari (rules of thumb, Kosen dan Ooterhius 1985). Tujuan percobaan ini adalah mendapatkan kriteria peningkatan skala yang paling baik untuk ekstraksi kitin dari kulit udang secara biologi. Selain itu juga untuk mengkarakterisasi proses dari setiap kriteria peningkatan skala yang digunakan. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari empat perlakuan kriteria peningkatan skala yaitu (A) koefisien transfer oksigen tetap (k L a), (B) tenaga per unit volume tetap (Pg/v), (C) tingkat aerasi tetap (F/V), dan (D) tingkat kecepatan ujung impeller tetap (V). Prosedur percobaan untuk proses demineralisasi berdasarkan metode Rao dan Steven (2005) yang dimodifikasi adalah sebagai berikut : Menyiapkan kulit udang, starter dan inokulum L. acidophilus FNCC116. Langkah selanjutnya yaitu sebanyak 600 ml (10 %, v/v) larutan inokulum dan 1800 gram (30 %, b/v) kulit udang segar dimasukkan ke dalam bioreaktor ukuran 13 liter yang telah diisi medium fermentasi sebanyak 5400 ml. Komposisi medium fermentasi tersebut terdiri dari glukosa 60 g/l dan ekstrak khamir 0,5 g/l.
Setelah itu difermentasi pada suhu ruang (30 o C ± 1 o C) dan diagitasi berdasarkan hasil perhitungan basis tenaga per unit volume tetap (Lampiran 45) Fermentasi menggunakan sistem subsequent batch, dengan penggantian medium pada jam ke 24. Waktu fermentasi dilakukan selama 36 jam Parameter pengamatan dilakukan terhadap kulit udang dan medium fermentasi. Pada kulit udang diamati kandungan abu (AOAC 1984) dan protein (metode Lowry et al. 1951 dimodifikasi) sedangkan pada medium fermentasi diamati jumlah bakteri (TPC), kandungan asam laktat (HPLC), ph (ph meter) dan kandungan glukosa (metode DNS, AOAC 1984). Pengambilan contoh dilakukan setiap 12 jam sekali dan dilakukan secara duplo. Data yang diperoleh dianalisis secara diskriptif dalam bentuk grafik. Prosedur percobaan untuk proses deproteinasi berdasarkan metode Shimahara et al. (1984) yang dimodifikasi adalah sebagai berikut : Kulit udang hasil demineralisasi ditimbang sebanyak 1800 gram (30 %, b/v), kemudian dimasukkan kedalam bioreaktor ukuran 13 liter. Setelah itu dimasukkan inokulum bakteri B. licheniformis F11.1 sebanyak 1200 ml dan medium fermentasi sebanyak 4800 ml. Penyiapan starter dan inokulum serta medium sebagaimana dilakukan pada percobaan B. Fermentasi dilakukan secara batch. Kondisi proses fermentasi adalah sebagai berikut : suhu dipertahankan 55 o C, ph medium dijaga pada kisaran 7,8 8,2, dan diagitasi serta diaerasi berdasarkan hasil penghitungan kriteria peningkatan skala yang dicoba (Lampiran 48). Fermentasi dilakukan selama 96 jam.
Pengamatan dilakukan terhadap kulit udang, dan medium fermentasi. Pengamatan terhadap kulit udang hasil demineralisasi selama dideproteinasi meliputi kandungan abu (AOAC 1984) dan protein (metode Lowry et al. 1951 dimodifikasi). Pengamatan terhadap medium fermentasi meliputi jumlah bakteri (TPC), dan aktivitas enzim protease (Azokasein). Pengambilan contoh dilakukan setiap 12 jam sekali dan diukur secara duplo. Data yang diperoleh dari penghitungan tingkat penurunan kandungan protein dianalisis secara statistik dengan uji F dan uji Jarak Barganda Duncan pada taraf kepercayaan 95 %. Adapun hasil pengukuran dari parameter yang lain dianalisis secara diskriptif dalam bentuk grafik.