13 3. BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Benih Departemen Agronomi dan Hortikultura, Kebun Percobaan Leuwikopo Institut Pertanian Bogor dan Kebun Percobaan Balai Penelitian Tanaman Buah Tropika Sumani, Sumatera Barat mulai bulan Desember 2011 sampai September 2012. 3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah alumunium foil, garam tetrazolium (2,3,5 triphenyltetrazolium chloride), gibereline acid (GA 3 ), silica gel, pasir, kain kasa, aquadest, aquabidest. Benih pepaya varietas Merah Delima, Dampit, Sukma, genotipe 1xD, 1x2, dan 6x9. Alat yang digunakan dalam penelitian antara lain: pisau, saringan, nampan plastik, oven, desikator, inkubator, cawan alumunium, timbangan analitik, waterbath, bak kecambah, foot sealer listrik, refrigerator freezer, mikroskop, lup, gelas ukur, silet, thermohigrometer, pinset dan alat tulis. 3.3 Metode Penelitian Sumber Benih Benih diambil dari buah yang masak dipohon dengan kriteria semburat 75 %. Buah pepaya: varietas Merah Delima, Dampit, genotipe 1xD, 1x2 berasal dari kebun percobaan Balitbu Tropika Solok Sumatera Barat, varietas Sukma dan genotipe 6x9 berasal dari KP. PKHT Pasir Kuda Ciomas, Bogor. Bentuk buah keenam jenis pepaya yang diuji terdapat pada (Lampiran 1). Benih yang diambil adalah 2/3 bagian, benih pada bagian ujung dibuang dan benih yang tenggelam yang akan digunakan. Benih dibersihkan dari sarkotesta dengan menggosok benih pada saringan dibawah air mengalir. Kemudian benih dikering anginkan (3-5 jam) diatas kertas koran sampai tidak ada air yang menetes dari benih, selanjutnya benih dikeringkan sesuai dengan kadar air percobaan. Penelitian terdiri atas tiga tahap yaitu:1) Studi dormansi benih pepaya dan perlakuan benih, 2) Pengujian ketahanan benih terhadap
14 desikasi dan 3) Pengujian ketahanan benih terhadap suhu rendah. Bagan alir penelitian pada Gambar 2. Percobaan. I : Studi dormansi dan perlakuan benih Petak Utama: 0, 2, 4, 6 dan 8 minggu Anak Petak: Benih tanpa perendaman Direndam air suhu (26-27 o C) selama 4 jam Heat shock :air panas 36 o C 4 jam kemudian air suhu 26 0 C 30 menit GA 3 1000 ppm selama 1 jam Percobaan II Pengujian ketahanan benih terhadap desikasi Petak Utama : Varietas/ genotipe pepaya : MerahDelima, Sukma, Dampit, 1xD, 1x2, 6x9 Anak Petak: Kadar air benih 4-6 %, 8-10 % 11-13 % Pengamatan: DB, IV, PTM, KCT Pengamatan DB, IV, PTM, KCT dan V TTz Lama dormansi masing-masing genotipe dan teknik pematahan dormansi yang terbaik Varietas/ Genotipe yang masih hidup(viabel) dengan kadar air benih 4-6 % Percobaan III Pengujian Ketahanan Benih Terhadap Suhu Rendah (-20 0 C) Pengamatan : DB, IV, PTM, KCT, V TTz Output: Intermediate atau Ortodoks Informasi pengembangan metode uji sifat benih pepaya Gambar 2. Bagan alir penelitian
15 3.4 Percobaan Studi Dormansi Benih Pepaya dan Perlakuan Benih Percobaan disusun terpisah berdasarkan varietas/genotipe pepaya yang diuji, dengan dua faktor yaitu waktu simpan dan perlakuan benih. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Petak Terbagi (Split Plot Design), yang disusun berdasarkan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor. Faktor pertama waktu simpan yaitu 0, 2, 4, 6 dan 8 minggu sebagai petak utama dan perlakuan benih sebagai anak petak, terdiri dari empat taraf yaitu (1) benih kering (kontrol), (2) perendaman dengan air biasa suhu 26-27 C selama 4 jam, (3) Heat shock yaitu perendaman benih dengan air panas suhu (36 ±1 ºC) selama 4 jam kemudian direndam kembali direndam dalam air suhu 26 C selama 30 menit (Wood et al. 2000), (4) perendaman benih dengan GA 3 1000 ppm selama 1 jam. Setiap kombinasi perlakuan diulang empat kali, masingmasing ulangan terdiri dari 25 butir benih. Model linear yang digunakan adalah : Keterangan : Y ijk : nilai pengamatan dari faktor lama penyimpanan benih ke-i, perlakuan benih ke j dan kelompok ke-k µ : faktor komponen aditif dari rataan umum : pengaruh faktor lama penyimpanan ke-i W i Y ijk = D ( WD) ε ijk μ + Wi + δik + j + ij + δ ik : komponen acak dari petak utama yang menyebar normal D j : pengaruh perlakuan benih ke-j β j : pengaruh utama faktor (WD) ij : komponen interaksi dari faktor lama penyimpanan dan faktor perlakuan benih ε ijk : pengaruh acak yang menyebar normal (0,σ 2 ) i : perlakuan lama penyimpanan benih j : perlakuan benih k : ulangan 1, 2, 3, 4 Benih diekstraksi dan dikeringkan sampai kadar air 12-13 % (dijemur 2-3 hari), kemudian disimpan ke dalam kantong alumunium foil
16 pada suhu kamar (26-28 C) dan RH (55-78%). Perlakuan kontrol 0 minggu benih langsung diuji daya berkecambahnya, selanjutnya pengujian daya berkecambah dilakukan pada 2, 4, 6 dan 8 minggu setelah simpan. Perlakuan heat shock dilakukan dengan merendam benih dalam waterbath dengan suhu 36 C selama 4 jam kemudian benih direndam pada air biasa suhu 26-27 0 C selama 30 menit. Pengujian daya berkecambah dilakukan pada media pasir steril dengan menggunakan bak pengecambah. 3.5 Percobaan Pengujian Ketahanan Benih terhadap Desikasi Percobaan disusun dalam Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan rancangan perlakuan Rancangan Petak Terbagi (split plot design) dua faktor. Petak utama adalah benih pepaya yaitu: varietas Merah Delima, Dampit, Sukma serta genotipe 1XD, 1x2 dan 6x9. Anak petak adalah kadar air benih yang terdiri dari 3 taraf yaitu kadar air 4-6 %, 8-10 % dan kadar air 12-14 %, sehingga didapatkan 18 kombinasi setiap kombinasi perlakuan. Pelaksanaan pengujian daya berkecambah dilakukan per ulangan yaitu empat kali ulangan sehingga didapat 72 satuan percobaan. Setiap ulangan menggunakan 25 butir benih sehingga dibutuhkan 1200 benih setiap genotipe atau varietas. Model rancangan yang digunakan adalah : Keterangan : Yijk : nilai pengamatan dari genotipe ke-i, kadar air benih ke-j dan ulangan ke-k μ : nilai rataan umum Gi : pengaruh genotipe ke-i δ ik Kj : komponen acak dari petak utama yang menyebar normal : pengaruh kadar air benih ke-j (GK)ij : interaksi antara genotipe ke-j dan kadar air benih ke-i ε ijk i j Y ijk = ( GK ) ε ijk μ + Gi + δik + Kj + ij + : komponen acak dari anak petak yang menyebar normal : perlakuan varietas/genotipe : perlakuan kadar air benih
17 Kadar air benih 4-6 %, 8-10 % dan 12-14 % didapatkan dengan cara benih dikeringkan dalam desikator yang berisi 0,5 kg silica gel /1000 benih suhu 28-30 ºC. Benih dibagi tiga bagian pertama untuk mendapatkan kadar air 4-6 % benih dikeringkan selama 4-5 hari (RH 25-30%), untuk mendapatkan kadar air 8-10 % benih dikeringkan selama 2-3 hari (RH 35-40 %) dan kadar air 11-13 % benih dikeringkan selama 1-2 hari (RH 45-50 %). Perhitungan kadar air berdasarkan ISTA (2010) dengan metode oven pada suhu 103 ± 2 C selama 17 jam ± 1 jam. Benih dikecambahkan sesuai perlakuan kadar air dengan menggunakan media pasir yang telah disterilkan pada bak perkecambahan diletakkan di rumah plastik (suhu 30-40 ºC) dan kelembaban relatif (50-80 %) bila cuaca cerah data. Suhu dan RH rumah plastik (Lampiran 2). Sebelum pengecambahan, benih di letakkan pada ruang dengan kelembaban tinggi secara bertahap untuk memberi kesempatan kadar air yang berkesetimbangan dengan RH, untuk menghindari kerusakan akibat desikasi. Pengamatan terdiri atas daya berkecambah (DB), uji cepat viabilitas dengan tetrazolium (V TTZ ), indeks vigor (IV), kecepatan tumbuh (K CT ) dan potensi tumbuh maksimum (PTM). Data dianalisis ragam dengan uji F jika terdapat pengaruh nyata dari perlakuan dilanjutkan dengan uji lanjut DMRT pada taraf 5 %. 3.6 Percobaan Pengujian Ketahanan Benih terhadap Suhu Rendah Percobaan disusun dalam Rancangan Acak Lengkap menggunakan benih varietas/genotipe yang sama dengan percobaan II, benih keringkan sampai kadar air 4-6 % dengan silica gel. Benih selanjutnya dikemas dengan alumunium foil sesuai varietas/genotipe dengan empat ulangan. Benih disimpan dalam freezer dengan suhu (-20 ±1 C) dengan RH (60-80 %) selama 2 x 24 jam, setelah itu dilakukan pengujian terhadap viabilitas benih. Sebelum pengujian daya berkecambah benih dikeluarkan dari frezeer ditempatkan dalam refrigerator selama 1 jam kemudian ruang AC suhu (18-20 ºC) kemudian ditempatkan pada suhu kamar selama satu jam menghindari kerusakan akibat perbedaan suhu.
18 Model rancangan yang digunakan adalah : = μ + τ + ε Yij Dimana : i = 1,2..perlakuan j= 1,2, 3, 4 = ulangan Y ij = pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = rataan umum τ i = pengaruh perlakuan ke i ε ij = pengaruh acak perlakuan ke-i ulangan k-j Benih dikecambahkan dengan media pasir steril menggunakan bak kecambah dari plastik mika berukuran 20 x 20 cm yang dietmpatkan di rumah kaca. Pengamatan terdiri atas kadar air (KA) setelah penyimpanan, daya berkecambah (DB), uji cepat viabilitas dengan tetrazolium (V TTZ ), indeks vigor (IV), kecepatan tumbuh (K CT ) dan potensi tumbuh maksimum (PTM). 3.7 Pengamatan 1. Kadar Air Benih (%) Penghitungan kadar air dilakukan dengan 3 ulangan sebanyak 50 butir benih setiap unit. Penghitungan menggunakan rumus (ISTA 2007) sebagai berikut : M2 M3 KA M2 M1 x 100 % Keterangan : KA : Persentase kadar air M1 : Bobot cawan + tutup M2 : Bobot cawan + tutup + benih sebelum dioven M3 : Bobot cawan + tutup + benih setelah dioven i ij 2. Uji daya berkecambah (%) Pengujian ini dilakukan untuk menentukan viabilitas benih secara fisiologis, benih di kecambahkan pada media pasir yang telah disterilisasi. Benih dikecambahkan dengan menanam 25 benih setiap ulangan pada bak perkecambahan. Bak perkecambahan ditempatkan dirumah kaca dengan sinar matahari penuh dan kelembaban media terjaga. Kriteria kecambah normal adalah apabila hipokotil tumbuh lurus dan sehat kotiledon telah
19 terbuka sempurna, disertai tunas yang sehat. Hitungan pertama pengamatan kecambah dilakukan pada 14 hari setelah tanam dan hitungan kedua dilakukan pada 21 hari setelah tanam (HST) (Nurlovi 2004; Sumartuti 2004), suhu perkecambahan dirumah plastik (Lampiran 2). Rumus untuk menghitung persentase daya berkecambah (DB) benih adalah: KN I KN II DB Jumlah benih yang ditanam x 100% Keterangan: DB : Daya berkecambah (%) KN I : Jumlah kecambah normal pada hitungan pertama (hari ke-14) KN II : Jumlah kecambah normal pada hitungan kedua (hari ke-21) 3. Kecepatan Tumbuh Pengujian dilakukan dengan mengamati jumlah kecambah normal yang muncul setiap hari mulai hari pertama hingga pengamatan kecambah hitungan kedua (21 HST). Kecepatan tumbuh (K CT ) dihitung dengan sebagai berikut : Keterangan: K CT d K CT : Kecepatan tumbuh benih (%/etmal) d : Tambahan persentase kecambah normal setiap etmal ( 1 etmal = 24 jam) 4. Indeks Vigor (IV) Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah kecambah normal yang muncul pada pengamatan hitungan pertama (hari ke 14). KN I IV 100 % Jumlah benih yang dikecambahkan Keterangan: IV = indeks vigor (%) KN = kecambah normal hitungan pertama (hari ke 14)
20 5. Potensi Tumbuh Maksimal (PTM) Potensi tumbuh maksimum benih diperoleh dengan menghitung jumlah benih yang berkecambah dengan kriteria perkecambahan yang ditinjau dari aspek fisiologi. Berdasarkan tinjauan ini benih dinyatakan berkecambah walaupun embrio baru memunculkan radikula (calon akar). Potensi Tumbuh Maksimum dihitung pada penghitungan kedua atau pada akhir periode pengamatan yang dilakukan pada 21 HST. Rumus penghitungan PTM dengan menggunakan rumus sebagai berikut : PTM Jumlah benih yang berkecambah Jumlah benih yang ditanam x 100 % 6. Uji Cepat Viabilitas dengan Tetrazolium V ttz ( %) untuk percobaan II dan III. Uji ini terhadap 25 butir benih pada setiap ulangan, dilakukan empat ulangan pengamatan berdasarkan metoda Shie dan Kuo (1999) (Gambar 3) yang dimodifikasi. Benih direndam selama 24 jam, seed coat (bagian yang hitam dari benih) dibuang, direndam larutan 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride 0.5 % suhu 37.5 C selama 3 jam dalam incubator. Selanjutnya keluarkan embrio dari kotiledon dengan memotong bagian basal benih ± 0,5 mm sehingga embrio bias dilepas dari kotiledon selanjutnya embrio diamati. Uji tetrazolium dimaksudkan untuk mengetahui keadaan benih yang sesungguhnya ketika benih tidak berkecambah sehingga dapat membedakan benih yang dorman atau benih yang sudah mati. Pengamatan pola pewarnaan untuk mengskoring benih viabel atau non viabel sesuai dengan pola pewarnaan Shie dan Kuo (1999).
21 Gambar 3 Penentuan viabilitas benih papaya berdasarkan pola pewarna dengan Tetrazolium (Shied dan Kuo 1999) Keterangan Gambar 3: Benih yang viable : 1. Embrio seluruhnya berwarna merah 2. Bagian tengah merah terang, radikula terwarnai, merah bagian lainnya. 3. Setengah distal dari kotiledon berwarna merah terang, merah bagian lainnya. Radikula1/3 ujung kurang terwarnai Benih non viable : 4. Lebih dari 1/3 ujung radikula tak terwarnai 5. Kotiledon berwarna merah terang 6. Radikula tak terwarnai 7. Embrio utuh berwarna merah terang atau warna buram 8. Lebih dari1/3 radikula tidak terwarnai, lainnya terwarnai merah terang 9. Kotiledon tak terwarnai 10. Bagian basal kotiledon dan radikula terwarnai merah terang 11. Embrio terwarnai merah terang 12. Embrio tidak terwarnai