3 Metode Penelitian 3.1 Alat-alat Alat-alat gelas yang dibutuhkan: Cawan petri untuk wadah media padat dan tempat membiakkan organisme Gelas erlenmeyer untuk wadah membuat media sekaligus tempat membiakkan organisme dalam kultur cair. Gelas ukur untuk mengukur volum larutan yang dipakai Spreader untuk menyebar kultur cair mikroorganisme di atas permukaan media padat Alat-alat pendukung yang dibutuhkan: Pipet volum untuk mengukur volum kultur cair yang akan disebar di media padat Spatula untuk mengambil bahan-bahan yang akan digunakan dari stok Tabung sentrifuga mikro untuk menampung kultur cair mikroorganisme yang akan disentrifuga. Tusuk gigi steril untuk menoreh mikroorganisme dari agar miring ke media padat yang baru. Alat atau mesin yang digunakan: Autoklaf All American tipe 25X untuk sterilisasi peralatan dan media yang dipakai Inkubator isoterm Fisher tipe 503 untuk proses inkubasi dalam pembiakkan mikroorganisme Lemari pendingin untuk menyimpan semua stok media Oven Heraem untuk mengeringkan kulit udang Pemanas Thermolyne mirak TM untuk memanaskan larutan kulit udang dalam proses isolasi kitin Ruangan laminar Oliphant VLF4/L.U.S S/No.334 untuk melakukan semua prosedur aseptik Sentrifuga mikro Hettich 22R untuk memisahkan sel mikroorganisme dari media cair Shaker ROSI 1000 TM (Reciprocating/Orbital Shaking Incubator) merk Thermolyne untuk pengocokkan dalam pembiakan mikroorganisme Sonikator untuk memecah sel mikroorganisme sehingga protein terisolasi
3.2 Bahan Actinomycetes, Serratia marcescens dan Candida albicans diperoleh dari laboratorium Bioproses Teknik Kimia ITB. Bahan-bahan untuk membuat media Luria Bertani (LB) padat: ekstrak yeast, BD (Becton, Dickinson and company), trypton, BD (Becton, dickinson and company) NaCl, Merck (Sodium chloride cryst-gr), bacto agar, BD (Becton, Dickinson and company) dan air destilasi, dari Sakura Medical. Bahan-bahan untuk membuat media Nutrient Broth (NB): beef extract, BD (Becton, Dickinson and company), NaCl, Merck (Sodium chloride cryst-gr), peptone, BD (Becton, Dickinson and company) dan air destilasi dari Sakura Medical. Bahan untuk membuat paper disc: kertas saring Whattman no.11 dibentuk bulat dan disterilisasi. Kitin diisolasi dari udang jerbun yang diperoleh dari supermarket Superindo Jl. Ir. H. Juanda Bandung. Getah karet diperoleh dari perkebunan karet Haurgeulis, Jawa Barat. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan getah karet adalah toluen p.a dan benzen p.a. Ammonium sulfat digunakan dalam fraksinasi kitinase yang dihasilkan Actinomycetes dan Serratia marcescens. NaCl, Merck (Sodium chloride cryst-gr) digunakan untuk membuat larutan NaCl fisiologis pada pencucian sel Actinomycetes dan Serratia marcescens. Ketoconazole tablet dan kalpanax cair yang dijual dipasaran digunakan sebagai kontrol positif antijamur. Kapas lemak, kasa steril, dan kertas aluminium digunakan untuk membuat sumbat. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Pembiakan Mikroorganisme Pada bibit Actinomycetes dalam media agar miring disentuhkan tusuk gigi steril. Tusuk gigi kemudian ditorehkan pada media LB padat yang telah dikeluarkan dari stok lemari pendingin. Proses dilakukan dalam laminar flow dan di dekat nyala api. Petri berisi LB padat yang telah ditoreh Actinomycetes ditutup rapat kembali lalu diinkubasi semalam dalam inkubator 37 0 C. 20
Setelah diinkubasi akan dihasilkan koloni tunggal Actinomycetes. Koloni tunggal kemudian diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dipindahkan ke dalam media NB cair. Media NB cair yang berisi koloni tunggal Actinomycetes lalu dikocok dalam shaker bersuhu 37 0 C dan berkecepatan 150 rpm. Cara yang sama dilakukan juga untuk menyiapkan kultur cair Serratia marcescens dan Candida albicans. 3.3.2 Identifikasi Aktivitas Antijamur Actinomycetes dan Serratia marcescens Kultur cair Candida albicans sebanyak 0,2 ml disebar secara aseptik menggunakan spreader di atas media LB padat. Setelah merata, di atasnya diletakkan paper disc. Paper disc telah lebih dahulu dicelupkan masing-masing pada kultur cair Actinomycetes, Serratia marcescens,dan larutan 1mg obat antijamur ketoconazole dalam 1ml akuades. Proses dilakukan dalam laminar flow dan di dekat nyala api. Petri lalu ditutup rapat dan diinkubasi dalam inkubator 37 0 C semalam. Setelah semalam zona bening di sekitar paper disc akan diamati sebagai daerah yang tidak ditumbuhi Candida albicans sekaligus daerah kerja senyawa antijamur yang dihasilkan Actinomycetes, Serratia marcescens, dan kontrol positif ketoconazole. 3.3.3 Identifikasi Aktivitas Antijamur Cairan Intrasel dari Actinomycetes dan Serratia marcescens Kultur cair Actinomycetes diambil sebanyak 1ml dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga mikro. Larutan lalu disentrifuga selama tiga menit dengan kecepatan 9000 rpm. Proses sentrifuga dilakukan pada suhu 4 0 C. Endapan yang dihasilkan dipisahkan dari supernatan lalu dicuci sebanyak tiga kali menggunakan larutan NaCl fisiologis. Setelah selesai endapan dilarutkan dengan akuades steril lalu disonikasi dalam keadaan dingin. Sonikasi dilakukan sebanyak tiga kali, masing-masing selama satu menit. Ke dalam larutan hasil akhir dicelupkan paper disc. Paper disc kemudian diletakkan di atas lawn Candida albicans yang telah disebar pada petri berisi media padat LB. Petri lalu diinkubasi semalam dalam inkubator 37 0 C. Setelah semalam zona bening di sekitar paper disc diamati sebagai aktivitas antijamur intrasel Actinomycetes. Hal serupa juga dilakukan untuk mempelajari aktivitas antijamur Serratia marcescens. 3.3.4 Isolasi Kitin dari Kulit Udang Jerbun Udang yang diperoleh dari supermarket Superindo dicuci bersih dengan air kran lalu dikupas. Kulit yang diperoleh dipisahkan dan dicuci kembali hingga bersih menggunakan air 21
hangat. Kulit udang yang sudah bersih dikeringkan dalam oven bersuhu 60 0 C selama kirakira 24 jam. Kulit udang yang telah dikeringkan ditimbang. Diperoleh 18,6 gram kulit udang kering. Setelah itu dilarutkan dalam HCl 1N dengan volum sepuluh kali berat kulit udang kering, dalam hal ini 186 ml Larutan diaduk dengan strirer selama tiga puluh menit. Larutan lalu disaring. Residu dicuci dengan akuades. Setelah dicuci residu dilarutkan dalam larutan NaOH 3,5% dengan volum sepuluh kali berat kulit udang kering, dalam hal ini 186 ml. Larutan residu kulit udang dalam NaOH 3,5% diaduk menggunakan strirer selama dua jam dengan suhu 65 0 C. Setelah selesai diaduk larutan lalu disaring. Residu yang diperoleh dari proses penyaringan dicuci dengan akuades sampai ph netral. Untuk mengukur ph digunakan kertas lakmus. Residu yang telah netral dikeringkan dalam oven bersuhu 60 0 C selama empat jam. 3.3.5 Identifikasi Aktivitas Kitinase Actinomycetes dan Serratia marcescens Langkah awal dimulai dengan membuat media LB padat yang mengandung bacto agar 0,8%. Ke dalam gelas erlenmeyer berisi 1 gram tripton, 0,5 gram yeast extract, 1 gram NaCl, dan 0,8 gram bacto agar ditambahkan akuades hingga volum mencapai 100 ml. Gelas erlenmeyer ditutup rapat dengan sumbat lalu disterilisasi menggunakan mesin autoklaf selama 15 menit pada tekanan 15 psi. Sebanyak 6 mg serbuk kitin dilarutkan dalam 3 ml LB padat yang mengandung 0,8% bacto agar. Segera sebelum menjadi padat larutan dituangkan ke atas stok petri berisi LB padat. Setelah lapisan tipis menjadi padat di atasnya diletakkan paper disc yang telah dicelupkan masing-masing pada kultur cair Actinomycetes dan Serratia marcescens. Petri kemudian ditutup rapat dan diinkubasi semalam dalam inkubator 37 0 C. Zona bening di sekitar paper disc yang akan muncul keesokan harinya diamati sebagai daerah lapis tipis kitin yang terdegradasi kitinase. Actinomycetes dan Serratia marcescens berperan sebagai sumber kitinase. 3.3.6 Identifikasi Aktivitas Antijamur Getah Pohon Karet Sebanyak 1 gram getah karet yang telah menjadi padat dilarutkan dalam 1 ml toluen p.a. Ke dalam larutan dicelupkan paper disc steril. Kultur cair Candida albicans diambil sebanyak 0,2ml dengan pipet volum lalu disebar di atas permukaan LB padat yang telah dicetak dalam petri. Setelah disebar merata 22
menggunakan spreader diatasnya diletakkan paper disc yang telah dicelupkan pada larutan getah karet dalam toluen p.a. Sebagai kontrol negatif diletakkan pula paper disc yang telah dicelupkan pada toluen p.a. Petri diinkubasi semalam dalam inkubator 37 0 C. Zona bening yang akan tampak menandakan aktivitas antijamur getah pohon karet. Cara yang sama diulangi, namun sebagai pelarut getah karet digunakan benzen p.a. 3.3.7 Fraksinasi Kitinase yang Dihasilkan Actinomycetes dan Identifikasi Aktivitas Antijamurnya Kultur cair Actinomycetes dalam media NB diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke tabung sentrifuga mikro. Kedalamnya dicampurkan 0,2g ammonium sulfat (20%b/v). Campuran dikocok hingga seluruh ammonium sulfat larut. Larutan lalu disentrifuga selama tiga menit dengan kecepatan 9000rpm. Endapan kemudian dipisahkan dari supernatan. Diperoleh endapan 1 dan supernatan 1. Endapan 1 selanjutnya dilarutkan dengan akuades steril dan disebut sebagai fraksi 1. Supernatan 1 dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga mikro yang baru. Ke dalamnya ditambahkan lagi 0,2 gram ammonium sulfat. Kini konsentrasi ammonium sulfat yang ditambahkan menjadi 40%(b/v). Setelah larutan homogen dilakukan sentrifuga dalam keadaan dingin selama tiga menit dengan kecepatan 9000rpm. Endapan dipisahkan lagi dari supernatan. Diperoleh endapan 2 dan supernatan 2 Endapan 2 yang diperoleh diperlakukan sama seperti endapan pertama dan disebut fraksi 2. Proses yang serupa diulang hingga empat kali. Endapan yang diperoleh dari konsentrasi ammonium sulfat 60% dilarutkan dengan akuades dan disebut sebagai fraksi 3. Sedangkan endapan yang diperoleh dari konsentrasi ammonium sulfat 80% disebut sebagai fraksi 4. 23