T[T?4 1 Y'jy 0oSY - * s - VERlFlKASl POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE BADA PLASMID pnltsl DEWGAM HlBRlDISASl SOUTHERN O!eh M A R D I F 27. 0387 1994 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR B O G O R
Mardi. Protease Di bawah Antonius F 27.0387. Verifikasi Potongan DNA Penyandi pada Plasmid pmtsl dengan Hibridisasi Southern. bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Suwanto. RINGKASAN Fragmen- f ragmen DNA genom dari Bacillus stearothermophilus DSM297, yang dipotong secara parsial dengan EcoRI, telah diklonkan dalam Escheri chia col i DH5a dengan menggunalcan plasmid prk415 sebagai vektornya (Candra, 1993). Namun E. coli rekombinan ini setelah ditumbuhkan dalam media yang mengandung susu skim, menampakkan daerah bening yang sangat sempit (kira-kira 1 mm) di sekitar koloni. Begitu juga, ketika diukur aktivitas enzimnya setelah ditumbuhkan dalam media kaldu Luria Bertani pada suhu 37OC selama 22 jam, hanya menarnpaklcan aktivitas 0.0455 U/ml. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk membuktikan adanya potongan DNA B. stearotherrnophilus DSM297 yang terklonkan dalam plasmid pmtsl serta melacak apakah potongan DNA itu merupakan DNA penyandi protease dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern. Sebagai pelacaknya digunakan DNA penyandi protease subtilisin dari B. subtilis DB104. Hasil elektroforesis gel agar mini pada tegangan 5 Volt/cm dan konsentrasi agarosa 1.2 % menunjukkan bahwa terdapat potongan DNA B. stearothermophilus DSM297 yang terklonkan dalam pmts1. Potongan DNA tersebut berukuran
sekitar 1.7 kilo pasang basa (sebagai standar digunakan 1 kb ladder). Konsentrasi agarosa yang tinggi dan penambahan l2nase pada tahap digestion dapat memperjelas visualisasi potongan DNA tersebut pada gel. Pencucian membran setelah hibridisasi dilakukan pada kondisi low stringency. Pencucian pertama dilakukan selama 2 x 5 menit pada suhu ruang dengan larutan (1xSSPE dan 0.1% SDS). Pencucian kedua dilakukan selama 2 x 15 menit pada suhu 37'~ (percobaan I) dan 30 c (percobaan 11) dengan larutan (0.1 x SSPE dan 0.1% SDS). Hasil hibridisasi menunjukkan bahwa potongan DNA tersebut bulcan merupakan gen penyandi protease subtilisin. Meskipun demikian, masih ada kemungkinan potongan DNA tersebut merupakan gen penyandi protease lainnya. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan DNA penyandi protease netral atau protease lain sebagai pelacaknya.
VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE PADA PLASMID pmtsl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN Oleh : M A R D I F 27 0387 SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 1 9 9 4 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
INSTITLTT PERTAEJIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN VERIFIKASI POTONGAN DNA PENYANDI PROTEASE PADA PLASMID pmtsl DENGAN HIBRIDISASI SOUTHERN SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk rnernperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GI21 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR Oleh : MARDI F 27 0387 Dilahirkan di Bagansiapiapi pada tanggal 25 Januari 1972 Tanggal lulus : 30 Agustus 1994 Disetujui, / Dosen Pembimbing I i' Dosen Pembimbing I1
KATA PEWGANTAR Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian protease yang diadakan di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas untuk Bioteknologi, IPB. Rangkaian penelitian ini bertujuan untuk menggali potensi Indonesia untuk berkiprah dalam produksi dan aplikasi protease, antara lain dengan mencari isolat mikroba asal Indonesia yang mempunyai potensi untuk memproduksi protease, memanfaatkan limbah untuk media fermentasi, dan meningkatkan produktivitas isolat tersebut dalam menghasilkan protease melalui rekayasa genetika. Penelitian ini merupakan kelanjutan penelitian yang dilakukan Ir. K.P. Candra, M.S. mengenai usaha pengklonan gen protease dari Bacillus stearothermophilus ke dalam Escherichia coli. Kedua penelitian ini dimaksudkan sebagai langkah awal dalam usaha melakukan rekayasa genetika terhadap isolat mikroba penghasil protease asal Indonesia pada penelitian berikutnya. Dengan demikian, kedua penelitian ini lebih diarahlcan pada penguasaan teknik dalam rangka alih teknologi. Sebagai langkah awal, banyak ditemui kesulitankesulitan karena keterbatasan Easilitas, bahan, dan informasi. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun dari pembaca sangat diharapkan untuk menyempurnakan penelitian-penelitian berikutnya dalam rangkaian penelitian ini Bogor, Agustus 1994 Penulis
Puji syukur kepada Tuhan Yang Mahabaik, atas rahmat dan kasih-nya telah memampukan penulis menyelesaikan skripsi ini. Penghargaan dan terimakasih sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada fjr. Ir. Maggy T. Suhartono, atas bimbingan, nasehat dan perhatiannya terhadap penulis selama mengerjakan penelitian dan menyelesaikan skripsi ini. Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan kepada Dr.Ir. Antonius Suwanto, atas segala bimbingan, pengarahan dan bantuannya selama ini. Beliaulah yang telah memperkenalkan betapa menariknya biologi molekuler kepada penulis. Terimakasih secara khusus juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Budiatman Satiawihardja, yang telah bersedia menguji dan mernberikan koreksi dan masukan untuk penyempurnaan skripsi ini. Penulis juga sangat berterimakasih kepada : Ir. Lili Rosana atas segala bantuannya, fisik maupun moril; Drs. Yaya Rukayadi; Ir. Felix M. Mesak; Ir. Utut Widyastuti, MS.; Ir. Suzanna Ristiarini; Ir. Ricky Wijaya; Junaedi serta rekan-rekan dan teknisi Lab. Mikrobiologi dan Biokimia, PAU Bioteknologi, IPE atas segala bantuan dan masukannya. Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Han Cung dan Silvi yang telah membantu mengedit naskah ini, serta teman-teman yang telah banyak memberikan bantuan dan dorongan moril : Agustina, Paul, Gunawan, Wandi, seluruh Keluarga Eks Kolese Loyola, pihak keluarga serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
DAFTAR IS1 Hal aman KATA PENGANTAR... UCAPAN TERIMAKASIH... DAFTAR IS1... DAFTAR GAMBAR... i ii iii v. DAFTAR LAMPIRAN... vi I. PENDAHULUAN... 1 I1. TINJAUAN PUSTAKA... 3 A. Gen Protease dari B. stearothermophilus, B. subtilis dan E. coli... 3 B. Plasmid... 6 C. Pengklonan Gen Bacillus sp.ke Beberapa Inang... 10 D. Elektroforesis Gel Agarosa Mini... 12 E. Hibridisasi Southern... 13 1. Teori Hibridisasi... 14 2. Hibridisasi Filter... 17 3. Deteksi... 18 111. BAHAN DAN METODE PENELITIAN... 21 A. Bahan dan Alat... 21 B. Metode Penelitian... 22 1. Isolasi DNA Plasmid... 23 2. Isolasi DNA Kromosom. 24 iii
3. Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi 4. Elektroforesis Gel Agarosa Mini... 5. Southern Blots... 6. Isolasi Fragmen yang Akan Dijadikan Pelacak... 7. Pelabelan DNA Pelacak... 8. Pemurnian DNA Pelacak... 9. Hibridisasi... : 10. Deteksi Hibridisasi... IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... A. Pertumbuhan Koloni pada Media SMMCA... B. Isolasi DNA... C. Elektroforesis Gel Agarosa Mini... D. Southern Blots... E. Isolasi, Pelabelan dan Pemurnian DNA Pelacak... F. Hibridisasi dan Deteksi... G. Analisis Hasil Pengklonan Gen B. stearo- thermophilus DSM297 ke dalam E. coli DH5a... V. KESIMPULAN DAN SARAN... A. Kesimpulan... B. Saran... DAFTAR PUSTAKA... LAMPIRAN