METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Penelitian Kimia Analitik, Fakultas Matematika dan IPA, Institut Pertanian Bogor mulai bulan Juni 2010 sampai bulan Oktober 2010. Materi Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat BAL indigenous dadiah (Lactobacilus plantarum D-01 dan Lactococcus lactis D-01), isolat BAL dari yogurt susu sapi (Bifidobacterium longum Y-01 dan Lactobacillus acidophilus Y-01), kultur bakteri uji (Salmonella enteritidis serotipe Typhimurium (S. Typhimurium) ATCC 14028, Eschericia coli ATCC 25922, dan Staphylococcus aureus ATCC 25923), Bacteorogycal Agar (BA), de Man s Rogosa Sharpe Broth (MRS-B), NaCl fisiologis 0.85%, aquadest, Mueller Hinton Agar (MHA), Nutrient Broth (NB), standar Mc Farland nomor 2, etanol Pro Analyzed (PA), Tris-HCl 0,05 mm ph 8, buffer 0,2 M sitrat ph 6.0, pepsin, tripsin, dan enzim katalase, PP 1%, NaOH 0,1 N, HCl 10 N dan NaOH 10 N. Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah tabung reaksi, ruang steril, cawan Petri, corke borrer, jangka sorong, mikroskop, labu Erlenmeyer, buret, mikropipet, autoklaf, inkubator, refrigerator, freezer, vortex, spektrofotometer, sentrifuge, tabung Scott, termometer, tabung U, waterbath, spuit 5 cc, rotary evaporator dan timbangan analitik. Prosedur Penelitian ini meliputi dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan meliputi persiapan starter, preparasi bakteri uji, dan pengukuran ph. Preparasi Kultur Starter. Koloni yang telah dimurnikan ditumbuhkan pada agar miring sebagai stock culture. Kultur ditumbuhkan ke dalam media MRS-B steril
sebagai kultur induk (penambahan sebanyak 5%). Kultur starter diremajakan satu hingga dua minggu sekali untuk menjaga kesegarannya. Preparasi Bakteri Patogen. Kultur bakteri patogen dipelihara dan diperbanyak dengan mengambil sebanyak satu massa Öse steril kultur bakteri stok dalam broth, diinokulasikan ke dalam 10 ml nutrient broth (NB), kemudian diinkubasi pada 37 o C selama 24 jam. Sebelum digunakan, kultur disimpan pada suhu 5 o C dan disegarkan kembali satu minggu sekali sebagai kultur stok. Pengujian yang dilakukan sebelum kultur BAL dan bakteri patogen digunakan adalah pengamatan morfologi didahului oleh pewarnaan Gram dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100. Pengujian pewarnaan Gram dilakukan dengan cara kultur bakteri sebanyak satu massa Öse dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan kristal violet, dibiarkan selama 1 menit. Preparat selanjutnya dibilas dengan akuadestilata dan dikeringudarakan. Preparat yang sudah kering ditetesi dengan larutan iodin dan didiamkan selama ±1 menit, kemudian dibilas kembali dengan akuades dan preparat selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama ±5 detik, dibilas kembali dengan akuadestilata dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama ±30 detik dan dibilas kembali dengan akuades, lalu preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diperiksa di bawah mikroskop. Bakteri dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif, bila dapat mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah. Karakteristik biokimia kultur bakteri salah satunya ditentukan melalui pengujian katalase dengan cara sebanyak satu jarum Öse kultur bakteri diambil dan dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan satu tetes H 2 O 2. Apabila dihasilkan gelembung-gelembung gas O 2, maka bakteri yang diperiksa termasuk kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya apabila tidak ada gelembung gas maka bakteri tersebut termasuk bakteri katalase negatif (Pelczar dan Chan, 2007). Penentuan Populasi BAL Indigenous Dadiah. Tahap ini bertujuan untuk mengetahui jumlah populasi BAL penghasil substrat antimikroba yang dihitung dengan pendekatan dua metode yaitu metode pour plate (hitungan cawan) dan metode turbidimetrik dengan spektrofotometer. Metode pour plate digunakan untuk 14
penentuan populasi BAL sebelum dan sesudah perlakuan, sedangkan metode turbidimetrik digunakan untuk penentuan perubahan populasi BAL selama perlakuan. Metode Hitungan Cawan (Bakteriological Analytical Manual, 2001). Tahap ini diawali dengan pengenceran yang dilakukan dengan cara sebanyak 1 ml sampel yang sudah homogen diambil dengan pipet steril, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer yaitu BPW, sehingga terbentuk pengenceran 10-1. Pengenceran terus dilakukan sampai pada pengenceran 10-9. Pemupukan dilakukan dengan pipet steril yaitu sebanyak 1 ml pada pengenceran 10-6, 10-7, 10-8 dan 10-9 diambil dan dipindahkan ke dalam cawan Petri steril, serta dipupukkan secara duplo. Media agar sebanyak 15 ml dituangkankan ke dalam cawan Petri dan dihomogenkan sampai merata (metode tuang atau pour plate) dengan cara cawan digerakkan membentuk angka delapan. Cawan beserta isi diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 37 C selama 24-48 jam. Koloni mikroba yang terbentuk dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC) dengan rumus sebagai berikut : Jumlah Populasi (cfu/ml) = N cawan (n 1 + (0,1 x n 2 )) x d Keterangan : N n 1 n 2 d = Jumlah koloni yang berbeda dalam kisaran hitung (25-250 koloni) = Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung = Jumlah cawan kedua yang koloninya dapat dihitung = Pengenceran pertama yang dihitung Metode Turbidimetrik (Waluyo, 2008). Tahap ini diawali dengan penentuan korelasi antara nilai optical density (OD) dengan populasi bakteri hasil pemupukan dengan metode pour plate, melalui persamaan y = a + bx (y = jumlah populasi BAL, x = nilai OD bakteri dan a dan b = konstanta persamaan). Persamaan linier yang didapat (y = a + bx) ini digunakan dalam penentuan populasi awal isolat bakteri L. plantarum dan L. lactis D-01, B. longum dan L. acidophilus Y-01. Perhitungan sel bakteri pada penelitian ini menggunakan metode spektrofotometri. Jumlah bakteri 15
dihitung berdasarkan absorbansi dengan panjang gelombang 620 nm (modifikasi Cappucino dan Sherman, 2001). Persamaan yang didapat dari kurva pertumbuhan Bifdobacterium longum adalah dengan variabel berupa banyaknya populasi bakteri (cfu/ml) yang dipupukkan dan perhitungan OD (optical density) menggunakan spektrofotometer dengan absorbansi 620 nm adalah y = 0,571x + 7,564 dengan koefisien determinasi (R²) = 0,942, sedangkan Lactobacillus acidophilus adalah y = 1,812x + 7,205 dengan koefisien determinasi (R²) = 0,976, Lactobacillus plantarum adalah y = 2,522x + 6,873 dengan koefisien determinasi (R²) = 0,978, serta Lactococcus lactis adalah y = 7,074 + 1,169x dengan R 2 = 0,936. Penelitian Utama Penelitian pendahuluan meliputi identifikasi substrat antimikroba (asam organik, bakteriosin dan hidrogen peroksida) dan karakterisasi antimikroba melalui pengujian stabilitas substrat terhadap berbagai ph dan suhu. Identifikasi Substrat Antimikroba melalui Uji Konfrontasi antara Bakteri Asam Laktat dengan Bakteri Patogen. Metode yang digunakan untuk uji konfontrasi keempat BAL terhadap berbagai bakteri uji adalah agar well difusion method (metode difusi sumur agar) sesuai dengan Héchard et al. (1992). Kultur bakteri uji berumur 24 jam dalam media NB diencerkan dalam NaCl fisiologis 0,85% untuk menghasilkan konsentrasi bakteri sebanding dengan larutan standar Mc Farland no.2 yang setara dengan tingkat populasi 10 8 cfu/ml, kemudian diencerkan hingga populasi mencapai 10 6 cfu/ml. Sebanyak 1 ml bakteri uji (10 6 cfu/ml) dipipet ke dalam cawan Petri dan ditambahkan Mueller Hinton Agar (MHA) sebanyak 15 ml, lalu dihomogenkan. Lubang berdiameter ± 7 mm dibuat setelah agar dalam cawan mengeras (modifikasi Nowroozi et al., 2004) menggunakan corke borer, kemudian dasar lubang dilapisi dengan Bacteorogical Agar (BA), FBS sebanyak 50 μl dari masing-masing BAL dipipet ke dalam masing-masing lubang sumur. Cawan beserta isi disimpan ke dalam refrigerator (suhu 4-7 o C) selama 1 jam untuk memberikan kesempatan FBS meresap ke dalam agar, sehingga akan memberikan aktivitas yang maksimal pada saat konfrontasi dengan bakteri uji. Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 18-24 jam, untuk pengujian kemampuan penghambatan 16
supernatan terhadap bakteri uji. Zona penghambatan yang terbentuk merupakan areal penghambatan substrat antimikroba BAL terhadap bakteri uji. Zona penghambatan berupa areal bening yang muncul di sekeliling sumur diamati dan diukur dengan jangka sorong. Setiap zona bening diukur diameternya sebanyak empat kali di tempat berbeda dan hasilnya dirata-ratakan kemudian dikurangi dengan diameter lubang (7 mm) (Gambar 1). Percobaan dilakukan dengan dua kali ulangan. C B A Keterangan: A: Sumur untuk supernatant bebas sel (7 mm) B: Zona hambat (zona bening) C: Cawan petri (media MHA) Garis / / / Pengukuran diameter zona bening Gambar 1. Metode Pengukuran Zona Hambat Beberapa peubah yang diuji dalam karakterisasi substrat antimikroba sebagai berikut: a. Asam Organik. FBS dari tiap BAL disiapkan sebelumnya dan diukur nilai ph dan Total Asam Tertitrasi (% asam laktat). - Pengukuran Nilai ph (Dewan Standardisasi Nasional, 1992). Nilai ph diukur dengan ph-meter setelah terlebih dahulu dikalibrasi dengan buffer ph 4,0 dan 7,0. Kalibrasi dilakukan setiap saat akan melakukan pengukuran. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan elektroda ke dalam sampel setelah dibersihkan dengan aquades dan skala dibaca saat muncul kata ready atau angka penunjuk telah berada pada posisi tetap. - Total Asam Tertitrasi (Dewan Standardisasi Nasional, 1992). Sampel diambil sebanyak 10 ml, kemudian ditambahkan 3 tetes larutan indikator (PP 1%). Sampel kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda. Perhitungan: Jumlah Asam Tertritasi = b x c x 90.08 x 100% a 17
dengan: a = volume sampel, dinyatakan dalam ml b = volume larutan NaOH, dinyatakan dalam ml c = normalitas larutan NaOH Tahap selanjutnya dilakukan uji konfrontasi FBS terhadap bakteri uji (S. Typhimurium, E. coli dan S. aureus) dengan metode difusi sumur agar. Jika ditemukan adanya zona hambat terhadap bakteri uji, membuktikan bahwa asam organik yang diproduksi merupakan salah satu senyawa antimikroba dari BAL tersebut. b. Bakteriosin. - Enzim Proteolitik (Modifikasi Oh et al., 2000). Masing-masing BAL diinokulasikan dalam media MRSB, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Sel-sel bakteri dipisahkan untuk didapatkan filtrat bebas sel (FBS) dengan disentrifugasi 6.000 g selama 20 menit pada suhu 4 o C. Filtrat masing-masing BAL diatur pada ph optimal tripsin, pepsin dan untuk kontrol, tiap FBS diatur pada ph 7 dengan penambahan NaOH 10 N untuk menghilangkan efek antimikroba dari asam organik di dalam substrat. FBS kemudian ditambah dengan etanol PA (pro analysis) dengan perbandingan 1:1, lalu dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 40-45 o C hingga kering dan ditambahkan aquadest steril untuk mendapatkan FBS terkonsentrasi menjadi 10 kalinya dari volume awal. FBS diberi perlakuan dengan penambahan enzim protease yang berbeda, pepsin dan tripsin (500 µg/ml). Tripsin pada buffer Tris-HCl 0,05 mm, ph 8 atau pepsin pada buffer 0.2 M sitrat ph 6.0 ditambahkan ke FBS dengan perbandingan FBS : enzim = 1:1 (v/v). FBS yang diberi perlakuan enzim pepsin diinkubasi pada suhu 37 o C, sedangkan untuk tripsin pada 25 o C masing-masing selama 1 jam. FBS yang telah mendapatkan perlakuan dengan enzim dikonfrontasikan dengan bakteri patogen indikator menggunakan metode difusi sumur agar (Savadogo et al., 2004). Jika zona hambat pada FBS yang diberi perlakuan enzim protease tidak terbentuk atau lebih kecil dari kontrol menandakan bahwa substrat antimikroba tersebut adalah protein atau dikenal sebagai bakteriosin. 18
- Uji Konfrontasi antar Bakteri Asam Laktat. Pengujian konfrontasi antara sesama bakteri asam laktat asal dadih dilakukan untuk mengetahui sensitivitas antar isolat BAL satu dengan yang lainnya, bila ditumbuhkan secara bersamaan sebagai kultur campuran. Cara pengujian sama dengan uji konfrontasi dengan bakteri patogen, hanya isolat BAL digunakan sebagai pengganti bakteri patogen. c. Hidrogen Peroksida (Modifikasi Dewan Standardisasi Nasional, 1992). Keberadaan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) dapat diuji dengan menggunakan uji katalase. Uji dilakukan secara duplo dengan tiga kali ulangan. Pengujian dilakukan dengan cara menuangkan 15 ml kultur berumur 24 jam ke dalam tabung U lalu ditambahkan 0,013 g enzim katalase (LPS). Mulut tabung ditutup dengan sumbat kapas, kemudian dihomogenisasikan. Tabung U diinkubasi dengan kondisi berdiri pada suhu 37 o C selama 3-24 jam diamati. Adanya gas oksigen yang terbentuk setelah penambahan enzim katalase dalam media yang diinokulasikan BAL menandakan bahwa BAL menghasilkan senyawa antimikroba berupa hidrogen peroksida (H 2 O 2 ). Karakterisasi Substrat Antimikroba melalui Pengujian Stabilitas Antimikroba pada Berbagai Level ph dan Suhu (Modifikasi Wolf dan Gibbons, 1996). a. FBS dikondisikan pada empat level ph yang berbeda (3,0; 5,0; 7,0; 8,0) dan diuji konfrontasi terhadap bakteri patogen dengan metode difusi sumur agar. b. FBS dikondisikan pada lima level suhu yang berbeda (-20 o C dan 4 o C dan disimpan selama 0, 7 dan 14 hari; 25-30 o C dan disimpan selama 1,2,3,4 dan 5 hari berturut-turut; 64±1 o C selama 30 menit; 74±1 o C selama 15 detik; dan dipanaskan hingga 100 o C). Pengujian aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi sumur agar. Rancangan Percobaan Penelitian utama terbagi menjadi dua tahap, yaitu identifikasi substrat antimikroba dan uji stabilitas substrat antimikroba probiotik terhadap berbagai kondisi ph, suhu dan lama penyimpanan. 19
1. Identifikasi substrat antimikroba dari bakteri asam laktat asal dadiah dan yogurt a. Asam Organik, menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah. b. Bakteriosin. - Pengujian adanya protein aktif (bakteriosin) melalui uji dengan enzim proteolitik (tripsin dan pepsin) menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah. - Pengujian kemampuan penghambatan antar bakteri asam laktat menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah. 2. Karakterisasi substrat antimikroba keempat bakteri probiotik a. Uji stabilitas terhadap empat level ph yang berbeda (3,0; 5,0; 7,0; 8,0), menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah. b. Uji stabilitas terhadap dua level penyimpanan suhu rendah yang berbeda (-18, 4 o C) menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Searah. c. Uji stabilitas terhadap tiga level suhu pemanasan yang berbeda (64±1 o C, 74±1 o C, 100 o C) menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial. d. Uji stabilitas pada penyimpanan suhu ruang selama lima hari menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial. Masing-masing perlakuan mendapat dua kali ulangan. Persamaan model rancangannya menurut Steel dan Torrie (1995) 1. Rancangan Acak Lengkap (RAL) Pola Searah Y ij = μ + α i + ε ij Keterangan: Y ij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ = Nilai rataan umum α i = Pengaruh level perlakuan penghambatan substrat dari tiap isolat BAL (a) bakteri uji (S. Typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923) (b) penyimpanan suhu rendah yang berbeda (-20 dan 4 o C) (c) masing-masing isolat BAL (d) enzim yang berbeda (pepsin dan tripsin) (e) empat level ph yang berbeda (3,0; 5,0; 7,0; 8,0) 20
ε ij = Galat percobaan akibat pada ulangan ke-j dari perlakuan ke-i Rancangan percobaan dapat berubah bila data yang diperoleh tidak memenuhi uji asumsi, yaitu dengan rancangan non parametrik Kruskall-Wallis. 2. Rancangan Acak Lengkap (RAL) Pola Faktorial Y ijk = μ + α i + β i + (αβ) ij + ε ijk Keterangan : Y ijk = Respon pengamatan pada perlakuan ke-i, perlakuan ke-j dan ulangan ke-k μ = Nilai rataan umum α i β j = Pengaruh perlakuan a) penyimpanan suhu ruang pada hari yang berbeda (H0-H5) b) perlakuan suhu pemanasan yang berbeda (64±1 o C, 74±1 o C, 100 o C) = Pengaruh perlakuan Bakteri Asam Laktat yang berbeda (Lactobacillus acidophilus Y-01, Lactobacilus plantarum D-01, Lactococcus lactis D-01 dan Bifidobacterium longum Y-01) (αβ) ij = Pengaruh interaksi perlakuan ke-i dan perlakuan ke-j ε ij = Galat percobaan pengaruh perlakuan ke-i, j dan ulangan ke-k Data yang diperoleh akan dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA), hasil yang berbeda nyata diuji lanjut dengan Uji Tukey dan interpretasi data dilakukan secara deskriptif (Steel dan Torie, 1995). 21