BAB III METODE PENELITIAN A. Subjek dan Objek Penelitian 1. Subjek Penelitian Subjek penelitian ini adalah ekstrak etanol daun pandan wangi. 2. Objek Penelitian Objek penelitian ini adalah aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun pandan wangi dalam berbagai variasi konsentrasi dan waktu pengujian. B. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol daun pandan wangi dan waktu pengujian. 2. Variabel Terikat Variabel terikat dalam penelitian ini adalah aktivitas antioksidan ekstrak daun pandan wangi pada minyak kelapa krengseng yang dinyatakan dalam persentase penghambatan oksidasi terhadap kontrol negatif. C. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a. Spektrofotometer Thermo-Genesys 20 b. Inkubator c. Evaporator Buchii 30
d. Vortex mixer e. Mikro pipet 1000-100 µl f. Botol flakon 10 ml berwarna bening bermulut sempit g. Alat-alat gelas meliputi: labu ukur, pipet ukur, erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, cawan kaca, dan gelas kimia, spatula 2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a. Daun pandan wangi b. Tanin (Berasal dari toko Chem-Mix) c. Minyak kelapa krengseng (Berasal dari pasar Gejayan) d. Etanol 96% p.a e. Akuades f. FeCl3 2% g. Buffer fosfat 0,05 M (ph 7,00) h. NH4SCN 30% i. FeSO4.7H2O 0,02 M j. HCl pekat k. Magnesium D. Tempat Penelitian 31
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Organik Jurusan Pendidikan Kimia, FMIPA, Universitas Negeri Yogyakarta. E. Prosedur Penelitian 1. Persiapan Bahan Uji Daun pandan wangi disortir sesuai dengan kriteria lalu dicuci bersih dengan air mengalir selanjutnya dilakukan pengecilan ukuran sebesar 3 5 cm. Daun pandan wangi yang telah dikecilkan lalu dikeringkan dengan oven selama 4 jam. Daun pandan wangi yang sudah kering diblender sampai halus, sehingga diperoleh serbuk daun pandan wangi. 2. Ekstraksi Daun Pandan Wangi dengan Metode Maserasi Sebanyak 40 g serbuk daun pandan wangi dimasukkan ke dalam jerigen, kemudian ditambahkan sebanyak 200 ml etanol 96% p.a, didiamkan selama 24 jam. Filtrat disaring, dan residu yang dihasilkan dimaserasi kembali dengan 200 ml etanol 96% p.a. Semua filtrat yang dihasilkan sebanyak 400 ml. Lalu dievaporasi pada suhu 60 0 C hingga diperoleh ekstrak daun pandan wangi. Ekstrak diuji secara kualitatif untuk mengetahui adanya kandungan fitokimia (flavonoid dan polifenol) yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan dan uji antivitas antioksidannya dengan metode FTC. 3. Screening Fitokimia Screening fitokimia dapat dilakukan dengan uji warna (kualitatif), yaitu untuk menentukan keberadaan senyawa golongan flavonoid dan uji adanya 32
senyawa polifenol. Keberadaan senyawa flavonoid dalam sampel dilakukan dengan uji wilstatter. Sedangkan uji adanya senyawa polifenol dilakukan dengan larutan penambahan FeCl3 adapun uji tersebut secara lengkap sebagai berikut: a. Uji Wilstatter Ambil ekstrak etanol daun pandan wangi 2 ml tambahkan 3 ml HCl pekat dan 2 3 potong kecil logam Mg. Perubahan warna yang terjadi diamati, yaitu merah sampai jingga untuk flavon dan hijau sampai biru untuk aglikon atau glikosida (Sarah dan Ratna, 2014: 3). b. Identifikasi Polifenol Ambil ekstrak etanol daun pandan wangi sebanyak 1 ml, masukkan dalam tabung yang pertama. Ambil tabung reaksi kedua sebagai kontrol positif yang diisi dengan larutan tanin. Ke dalam kedua tabung masing-masing ditambahkan 3 tetes pereaksi FeCl3 (Nur Ismiyati, et al., 2015: 345). Terjadinya warna biru kehitaman menunjukkan adanya tanin galat sedang warna hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin katekol (Tri Utami Putri (2014: 18-19) dalam Ayu Sulung, 2016: 67). 4. Uji Aktivitas Antioksidan Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode FTC. Langkahlangkahnya sebagai berikut: a. Persiapan larutan sampel uji Larutan induk ekstrak etanol daun pandan wangi 1 % mg/ml ( b /v) dalam etanol p.a (1 gram ekstrak etanol daun pandan wangi ditambahkan 100 33
ml etanol 96% p.a). Lalu membuat variasi konsentrasi dari ekstrak etanol daun pandan wangi 0,01% ( b /v); 0,05% ( b /v); dan 0,1% ( b /v). b. Pembuatan larutan blanko, kontrol negatif, dan kontrol positif Larutan blanko adalah larutan yang seluruh komponennya sama dengan larutan sampel, tetapi larutan sampel diganti dengan akuades. Sebelum membuat kontrol positif, terlebih dahulu dibuat larutan induk tanin, yaitu melarutkan 1 gram kristal tanin dalam 100 ml etanol p.a hingga batas. Selanjutnya dari larutan induk tanin tersebut dibuat larutan tanin dengan konsentrasi 0,05%. Setelah larutan tanin 0,05% jadi, maka diambil 4 ml dan ditambah 4,1 ml minyak kelapa krengseng 2,51% dalam etanol p.a, juga 8 ml buffer fosfat 0,05 M dan 3,9 ml akuades. Sebagai kontrol negatif adalah 4,1 ml minyak kelapa krengseng 2,51% dalam etanol p.a, ditambahkan 8 ml buffer fosfat 0,05 M (ph 7) dan 3,9 ml akuades. c. Penentuan panjang gelombang maksimum kontrol negatif Penentuan panjang gelombang yang menghasilkan serapan maksimum diukur pada rentang panjang gelombang antara 400 550 nm dengan mengukur absorbansi dari larutan kontrol negatif yang telah direaksikan dengan reagen hingga terbentuk kompleks berwarna merah [Fe(SCN)6] 3-. Mula-mula mengambil 0,1 ml larutan kontrol negatif kemudian menambahkan 9,7 ml etanol 96% p.a dan 0,1 ml NH4SCN 30%, dikocok hingga homogen dan didiamkan selama 3 menit. Setelah itu, menambahkan 0,1 34
ml FeSO4 0,02 M yang dilarutkan dalam HCl 3,5% dikocok hingga homogen dan didiamkan selama 6 menit. Tepat 6 menit setelah penambahan FeSO4, dilakukan pengukuran dengan menggunakan Spektrosfotometer UV-20 sampai diperoleh panjang gelombang pada serapan maksimum. d. Penentuan waktu kestabilan kontrol positif Waktu kestabilan, yaitu waktu yang menghasilkan absorbansi yang stabil dari larutan yang sebelumnya digunakan untuk penentuan panjang gelombang maksimum. Untuk menentukan jangka waktu larutan yang menghasilkan absorbansi stabil, pengukuran absorbansi dilakukan terhadap larutan kontrol positif pada panjang gelombang maksimum selama 20 menit dengan selang waktu pengukuran setiap 1 menit. Waktu kestabilan ditetapkan berdasarkan absorbansi yang tetap (stabil) pada selang waktu tertentu yang telah digunakan untuk pengukuran absorbansi tersebut. e. Pengujian aktivitas antioksidan (Yondra, Christine, dan Hilwan, 2014:363) Setiap sampel ekstrak etanol daun pandan wangi pada berbagai variasi konsentrasi diambil 4 ml (dilakukan secara triplo), lalu ditambahkan 4,1 ml minyak krengseng 2,51% dalam etanol p.a, 8 ml buffer fosfat 0,05 M, dan 3,9 ml akuades. Kemudian diinkubasi pada suhu 55 C selama 24 jam. Setelah itu diambil sebanyak 0,1 ml dan ditambahkan 9,7 ml etanol p.a, 0,1 ml NH4SCN 30% dan dihomogenkan, lalu didiamkan selama 3 menit. Setelah itu ditambahkan 0,1 ml FeSO4 0,02 M dalam HCl 3,5% dan kembali dihomogenkan. Terakhir, dilakukan pengukuran pada panjang gelombang 35
maksimum dan waktu kestabilan. Setiap sampel diukur kembali absorbansinya setelah 24 jam berlalu selama 8 hari. Dengan kata lain, pengukuran absorbansi sampel pada setiap konsentrasi dilakukan pada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 hari. F. Teknik Analisis Data Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif untuk mengetahui kemampuan ekstrak etanol daun pandan wangi dalam menghambat proses oksidasi pada minyak kelapa krengseng. Melalui prosedur kerja yang telah dilakukan, maka diperoleh data kualitatif dan kuantitatif senyawa antioksidan dalam ekstrak etanol daun pandan wangi. Data tersebut selanjutnya digunakan sebagai dasar dalam perhitungan aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun pandan wangi pada berbagai variasi konsentrasi dan waktu pengujian. Data yang diperoleh dari uji kuantitatif, yaitu data hasil pengukuran absorbansi pada uji peroksida dan data persentase penghambatan oksidasi oleh antioksidan. Aktivitas antioksidan dihitung berdasarkan persentase inhibisi (%I) oksidasi terhadap kontrol negatif. Semakin besar persentase berkurangnya absorbansi, maka penghambatan oksidasi akan semakin besar atau kuat. Adapun perhitungan aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan rumus: Keterangan: % I = Persentase Inhibisi (hambatan) AK = Absorbansi kontrol negatif = Absorbansi sampel AS % I = A K A S A K x 100% 36
Dari data absorbansi yang diperoleh dibuat persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi bahan uji (x) dengan aktivitas antioksidan rata-rata (y) dari sampel ekstrak daun pandan wangi yang terukur sehingga diperoleh harga IC50 yaitu konsentrasi uji yang dapat menangkap 50% radikal peroksida dari persamaan: Y = a + bx (Rahmawati et al., 2009: 98) Untuk penentuan IC50 dapat dihitung dengan menggunakan rumus: IC 50 = 50 a b Keterangan: Y = % aktivitas a = Intercept (pemotongan garis di sumbu Y) b = Slope (kemiringan) X = Konsentrasi 37