8 Prosedur Analisis Data Analisis statisik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan ulangan 3 kali dengan model linier yang digunakan (Matjik dan Sumertajaya 22) adalah: Yij = µ + πi + ßj + εij µ = pengaruh rataan umum πi = pengaruh hidrolisis laktosa β-galaktosidase pada jam ke-i; ßj = pengaruh ulangan ke-j εij = pengaruh galat hidrolisis laktosa oleh β - galaktosidase pada jam ke-i dan ulangan ke-j i= Jam ke-, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, dan 24, j = 1,2,3. Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf.5. Analisis data dengan SPSS 1.. Jika hasil uji berbeda nyata maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan. 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Optimasi Waktu Produksi Enzim Galaktosidase Waktu produksi ditentukan berdasarkan aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi, yaitu dari jam ke-24 sampai ke-36 dimana kurva pertumbuhan mengalami peningkatan dengan aktivitas total sebesar 27.669 U dan mengalami penurunan pada jam ke-42. Pemanenan dilakukan pada waktu produksi β- galaktosidase optimum yaitu pada waktu jam ke-24 dimana pada waktu tersebut aktivitasnya meningkat sebesar 26.65 U/ml. Dan bakteri tersebut menghasilkan β-galaktosidase pada fase eksponensial hingga jam ke-24 dengan nilai OD sebesar 1.984 atau setara dengan 1.81x1-8 sel/ml (Data Lampiran 6).
9 Jumlah sel/ml 2E-8 1.8E-8 1.6E-8 1.4E-8 1.2E-8 1E-8 8E-9 6E-9 4E-9 2E-9 6 12 18 24 3 36 42 48 Jam ke- 3 25 2 15 1 5 Aktivitas(U/ml) Gambar 1 Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-21( )dan kurva β-galaktosidase BAL indigenos strain D-21( )Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D- -galaktosidase Produksi dan Purifikasi β-galaktosidase Berdasarkan hasil penelitian, aktivitas spesifik β-galaktosidase kasar yang diperoleh adalah sebesar 138.396 U/ml (Tabel 1). Purifikasi selanjutnya dilakukan pengendapan dengan amonium sulfat. Pengendapan dilakukan pada konsentrasi optimum yaitu 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. Pada Gambar 2 menunjukkan bahwa pengendapan enzim dengan ammonium sulfat mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 4-5% (Data Lampiran 7). Aktivitas spesifik menurun pada fraksi lebih dari 5% karena pada fraksi tersebut lebih banyak enzim yang terendap bukan enzim β-galaktosidase. Aktivitas spesifik β-galaktosidase hasil semipurifikasi ammonium sulfat pada fraksi 4-5% adalah sebesar 238.438 U/mg. Aktivitas spesifik enzim kasar lebih rendah dibandingkan aktivitas spesifik enzim pengendapan dengan ammonium sulfat karena konsentrasi protein yang diperoleh pada enzim kasar lebih tinggi dibandingkan hasil pengendapan dengan ammonium sulfat sebesar.365 mg (Tabel 1). Tingkat kemurnian pengendapan dengan ammonium sulfat dan mengalami peningkatan dari 1 kali menjadi 2.97 kali dan rendemen sebesar 62.88%.
1 Total Aktivitas (U).7.6.5.4.3.2.1 1 2 3 4 5 6 7 Fraksi Ammonium Sulfat % 1.6 1.4 1.2 1..8.6.4.2 Total Protein (mg) Gambar 2 Hasil semipurifikasi dengan garam ammonium sulfat aktivitas total ( )dan total protein( ) Tabel 1 Purifikasi Parsial dari BAL indigenos strain D-21 Tahapan Total Aktivitas (U) Total Protein (mg) Aktivitas Spesifik (U/mg) Rendemen (%) Kemurnian (kali) Enzim Kasar 138.396 1.729 8.43 1 1. Pengendapan AmoniumSulfat 87.3.365 238.438 62.88 2.97 4%-5% Dialisis 5.42.27 243.574 36.43 3.4 Purifikasi parsial β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-21 hasil penngendapan selanjutkan dilakukan dialisis. Β-galaktosidase hasil dialisis menunjukkan total aktivitas adalah sebesar 5.42 U, total protein sebesar.27 mg dan aktivitas spesifik sebesar 243.574 U/mg drngan tingkat kemurnian meningkat sebesar 3.4 kali. Rendemen yang dihasilkan sekitar 36.43% (Tabel 1). Karakterisasi β-galaktosidase Suhu Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kinerja enzim. Gambar 3 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil optimum pada suhu 45 o C dan 4 o C dengan aktivitas sebesar 18.93 U/ml dan 43.194 U/ml, Bila kenaikan suhu jauh di atas suhu optimum maka enzim akan terdenaturasi. (Data Lampiran 8). Aktivitas relatif β-galaktosidase amobil pada
suhu 4 o C lebih rendah yaitu 7.85% dibandingkan aktivitas relatif β-galaktosidase bebas dapat bertahan sampai 75.5%. 11 Aktivitas Relatif(%) 12 1 8 6 4 Gambar 4a menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase 2 25 3 35 4 45 5 55 Suhu Gambar 3 Profil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase Enzim bebas relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam dengan suhu 25 sampai 4 o C dengan aktivitas tersisa masing-masing sebesar.22% dan.14% dari aktivitasnya. Gambar 4b menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase teramobil yang relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam dengan aktivitas tersisa sebesar 7.75% dan 2.1%. Aktivitas Tersisa(%) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 79.94 82.78 5.67 49.98 (b) 16.32.22.14 25 3 35 4 45 5 55 Suhu
12 Aktivitas Tersisa(%) 1 8 6 4 2 88.15 76.66 64.82 69.49 31.8 7.75 2.1 25 3 35 4 45 5 55 suhu (b) Gambar 4 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas β- galaktosidase bebas dan teramobil (b) ph Beberapa keadaan yang mempengaruhi kinerja enzim salah satu diantaranya adalah ph dimana β-galaktosidase bebas mencapai optimum pada ph 6.5 dengan aktivitas tertinggi sebesar 252.341 U/ml, sedangkan β-galaktosidase amobil pada ph 6 dengan aktivitas sebesar 4.428 U/ml. Gambar 5 menunjukkan optimasi ph β-galaktosidase bebas cenderung lebih rendah yaitu ph 6.5 dengan aktivitas sebesar 252.341 U/ml sedangkan β-galaktosidase teramobil optimasi tertinggi dikisaran ph 6 dengan aktivitas sebesar 4.428 U/ml. Aktivitas relatif enzim amobil tercapai sampai 1%. 12 Aktivitas Relatif(%) 1 8 6 4 2 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. ph Gambar 5 Profil hasil pengujian pengaruh ph terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas( ) dan teramobil( )
13 Aktivitas Tersisa(%) 45. 4 35. 3 25. 2 15. 1 5. 39.42 4.83 41.32 35.11 34.75 31.12 17.36 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. ph Aktivitas Tersisa(%) 8 7 6 5 4 3 2 1 67.64 65.71 69.18 6.7 43.37 9.47 1.63 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. ph (b) Gambar 6 Profil hasil pengujian ph terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas dan teramobil (b) Enzim β-galaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam pada ph 5. sampai 8. karena masih menyisakan aktivitas 4% (Data Lampiran 9). Gambar 6a dan 6b aktivitas β-galaktosidase masih relatif stabil dengan aktivitas tersisa pada β-galaktosidase bebas sebesar 4.83% dan β-galaktosidase teramobil sebesar 43.37%.
14 Aktivator dan Inhibitor Kation Hg 2+ dan Cu 2+ merupakan inhibitor kuat β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-21 karena dapat menurunkan aktivitas sebesar 26.35% dan 53.97% dari kontrol (yaitu enzim yang tidak mendapatkan penambahan kation). Kation Ca 2+, Co 2+, Zn 2+ dalam penelitian ini juga meningkatkan aktivitas β-galaktosidase dari kontrolnya sebesar 76.56%, 73.64% dan 61.5% (Data Lampiran 1). Beda halnya dengan Mn 2+ dan Mg 2+ memiliki masing masing aktivitas dari kontrol sebesar 12 % dan 114 %. 4 35 3 294.946 31.147 337.116 Aktivitas (U/mL) 25 2 15 1 5 225.488 216.186 18.217 3.532 19.8 Kontrol Ca Co Zn Cu Mn Hg Mg Ion - ion Logam Gambar 7 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-21 Parameter Kinetik. Penentuan nilai KM dan Vmaks dilakukan dengan pemetaan data dengan persamaan Lineweaver Burk (gambar 9). Persamaan Lineweaver Burk adalah y = 5.286x + 1.75 dengan nilai R 2 sebesar.971 sehingga kecepatan maksimum aktivitas β-galaktosidase sebesar.93 µmol/menit dan nilai KM sebesar,491 mm. Pada β-galaktosidase teramobil terjadi peningkatan konsentrasi substrat dan peningkatan kecepatan reaksi. Untuk persamaan reaksi Lineweaver Burk untuk β-galaktosidase teramobil adalah y= 3.74x+2.16 diperoleh nilai 1/Vmaks = 2.16 dan nilai KM/Vmaks = 32.74. Maka nilai Vmaks =.474 µmol/menit dengan nilai KM sebesar 15.54 mm (Data Lampiran 12).
15 1/V 18 16 14 12 1 8 6 4 2 y = 5.286x + 1.75 R² =.971 5. 1 15. 2 25. 3 35. 1/S 25. 2 y = 32.74x + 2.16 R² =.962 15. 1/V 1 5..1.2.3.4.5.6.7 1/S Optimasi Konsentrasi Alginat dan CaCl2 untuk Amobilisasi sel dan amobilisasi β-galaktosidase Bakteri Asam Laktat Indigenos Strain D-21 Interaksi dengan berbagai variasi jumlah beads dan konsentrasi alginat menghasilkan produk ONP yang berbeda nyata, dengan 4 variasi konsentrasi alginat yang berbeda yaitu 2%, 3%, 4% dan 5% (b/v) dengan inkubasi selama 1 jam konsentrasi alginat untuk sel amobilisasi yang diperoleh adalah sebesar 2% dengan jumlah beads 57 Konsentrasi alginat 2%, 3%, 4% dan 5% dengan variasi konsentrasi CaCl2.1 M,.3 M,.5 M terlihat bahwa untuk sel konsentrasi CaCl2 optimum pada konsentrasi.1 M untuk natrium alginat 2% sedangkan enzim untuk konsentrasi CaCl2 optimum pada konsentrasi.1 M dan natrium alginat 3%. (b) Gambar 8 Kurva lineweaverburk dari beta-galaktosidase bebas dan teramobil (b)
16 Produk onp (µmol) 5 4 3 2 1 47.56 46.63 33.3 29.58 32.6 2.74 2.12 21.67 14.54 15.62 11.91 5.75 2 3 4 5 Konsentrasi alginat Calsium klorida,1m Calsium klorida,3m Calsium klorida,5m Produk onp(µmol) 6 49.42 51.59 5 44.31 41.98 4 33.45 33.45 3 2.58 22.14 2 15.93 14.23 11.59 8.18 1 2 3 4 5 Variasi konsentrasi alginat (%) Calsium klorida,1m Calsium klorida,3 M Calsium klorida,5 M (b) Gambar 9 Variasi konsentrasi alginat dan CaCl2 untuk penggunaan enzim amobil dan sel amobil (b) Gambar 9a menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada enzim adalah 2% dengan konsentrasi CaCl2.1 M dengan jumlah produk yang dihasilkan sebesar 47.56 µmol ONP, CaCl2.3 M sebesar 2.74 µmol ONP dan CaCl2..5 M sebesar 29.58 µmol ONP. Gambar 9b menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada sel adalah 3% dengan konsentrasi CaCl2.1 dengan jumlah produk yang dihasilkan sebesar 49.42 µmol ONP, CaCl2.3 M dan CaCl2.5 M jumlah produk ONP yang dihasilkan masingmasing sebesar 41.98 µmol dan 8.8 µmol.
17 12 47.56 46.63 1 8 2.12 Interaksi dengan berbagai 49.42 variasi jumlah 51.59beads dan konsentrasi 21.67 6 alginat 44.31 4 33.45 2 2 3 4 5 Konsentrasi alginat (%) Produk ONP(µmol) Gambar 1 Optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel ( )dan amobilisasi enzim( ) Optimasi Konsentrasi Enzim β-galaktosidase dan Sel Untuk Amobilisasi Pada Hidrolisis Laktosa Variasi penggunaan konsentrasi alginat pada β-galaktosidase dapat dilihat pada gambar 11 terdapat 3 variasi bobot yaitu 5%, 1% dan 2%. Pada bobot konsentrasi alginat 5 % cenderung lebih kecil produk yang dihasilkan yaitu sebesar 4.22 µmol sedangkan untuk bobot konsentrasi alginat 1% diperoleh produk sebesar 55.626 µmol.. Produk (μmol) 1 8 6 4 2 91.752 55.626 4.22 5% 1% 2% Konsentrasi Alginat Gambar 11 Variasi Penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi β-galaktosidase pada hidrolisis laktosa Hasil penelitian menyatakan semakin banyak konsentrasi alginat pada enzim β-galaktosidase untuk amobilisasi pada hidrolisis laktosa maka semakin banyak
18 produk yang dihasilkan yaitu pada konsentrasi alginat 2% jumlah produk ONP sebesar 91.752 µmol. Konsentrasi alginat yang dipergunakan pada sel amobil untuk hidrolisis laktosa adalah sebesar 4%, 8% dan 12% (b/v). 6 53.2 58.884 Produk (μmol) 4 2 37.25 4% 8% 12% Konsentrasi Alginat Gambar 12 Variasi penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel pada hidrolisis laktosa Gambar 12 menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amoblisasi pada hidrolisis laktosa untuk bobot konsentrasi alginat 4% paling rendah dibandingkan bobot alginat 8%. Untuk konsentrasi alginat 4% yaitu sebesar 37.25 µmol dan kosentrasi 8% sebesar 53.2 µmol. Konsentrasi alginat 12% adalah konsentrasi dengan jumlah produk yang tertinggi sebesar 58.884 µmol. Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT Potensi hidrolisis sel bebas dan amobil dilakukan dengan sistem batch selama 24 jam pada suhu 45 o C selama 24 jam dan sampling dilakukan tiap 3 jam serta analisis laktosa terhidrolisis Pada gambar 14a hasil hidrolisis laktosa oleh sel BAL Indigenos strain D-21 pada sel teramobil meningkat yaitu pada jam ke-6 dengan aktivitas relatif sebesar 76.72% dengan jumlah laktosa terhidrolisis sebesar.366 g. Aktivitas relatif enzim teramobil tertinggi mencapai 62.68% dan mencapai optimum pada jam ke-18 dengan laktosa terhidrolisis sebesar.299 g (Data Lampiran 13). Aktivitas relatif(%) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 3 6 9 12 15 18 21 24 jam ke- Gambar 13 Potensi hidrolisis laktosa sel teramobil
19 Aktivitas hidrolisis relatif(%) 7 6 5 4 3 2 1 3 6 9 12 15 18 21 24 Jam ke Gambar 14 Potensi hidrolisis laktosa enzim teramobil (b) Aktivitas hidrolisisrelatif(%) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 3 6 9 12 15 18 21 24 Jam Ke- Gambar 15 Potensi hidrolisis laktosa sel bebas ( ) dan enzim bebas( ) Pada gambar 15 menunjukkan bahwa potensi hidrolisis laktosa pada sel bebas dan enzim bebas mencapai aktivitas relatif masing-masing sebesar 73.37% dan 89.93% dengan jumlah laktosa terhidrolisis masing-masing sebesar.35 g dan.429 g. Analisis statistik terlihat bahwa aktivitas relatif sel teramobil dengan enzim teramobil terdapat perbedaan nyata (α=.5) terhadap lamanya waktu aktivitas relatif dan tidak ada perbedaan nyata terhadap aktivitas hidrolisis relatif untuk sel bebas dan enzim bebas. Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil Pemilihan amobilisasi dengan natrium alginat dipandang lebih aman dan murah Penggunaan berulang sel dan enzim setelah diamobilisasi adalah untuk memisahkan antara enzim dan produk yang dihasilkan. Sehingga enzim dapat dipakai berulang kali dan aktivitas tetap stabil. Sel amobil dan enzim amobil
2 dimasukkan kedalam susu UHT lalu diinkubasi goyang untuk sel amobil pada suhu 4 o C dan enzim amobil pada suhu 45 o C kemudian dianalisis dengan menggunakan kit enzimatik GOD-POD. Penggunaan berulang butiran gel dilakukan sebanyak 6 kali dan terlihat penurunan aktivitasnya untuk sel dan enzim teramobil masing-masing sebanyak 42.35% dan 53.68%. Pada gambar 16a menunjukkan aktivitas hidrolisis relatif sel teramobil untuk pemakaian ulangan ke-6 masih menyisakan aktivitas sebesar 39.53%.Pada gambar 16b pemakaian ulangan ke-6 menyisakan aktivitas hidrolisis relatif sebesar 57.65% dari aktivitas awalnya sebesar 1%. Aktivittas Hidrolisis Relatif(%) 12 1 8 6 4 2 1 76.19 52.86 47.71 46.66 39.52 1 2 3 4 5 6 Ulangan ke- Aktivitas hidrolisis Relatif(%) 12 1 8 6 4 2 1 64.1 62.83 6.76 54.86 53.68 1 2 3 4 5 6 Ulangan ke- (b) Gambar 16 Penggunaan berulang sel teramobil dan enzim teramobil (b)