III. METODOLOGI A. BAHAN DAN ALAT Bahan baku utama yang digunakan pada penelitian ini adalah rimpang jahe segar yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Aromatik dan Obat (Balitro) Bogor berumur 8 bulan. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini meliputi pelarut heksan p.a, etil asetat p.a, etanol p.a dan gas nitrogen yang diperoleh dari Laboratorium ITP, IPB untuk tahap ekstraksi serta beberapa bahan lain seperti KH 2 PO 4 sebagai larutan pengencer, pelarut DMSO dan kloramfenikol untuk tahap pengujian aktivitas antimikroba. Kultur bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah beberapa bakteri yang tergolong bakteri patogen. Jenis bakteri yang digunakan yaitu: bakteri pembentuk spora (Bacillus cereus ATCC 13061), bakteri Gram-negatif (Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028), bakteri Gram-positif (Staphylococcus aureus ATCC 25923) yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas (PAU) Pangan dan Gizi, IPB. Media yang digunakan yaitu media Nutrien Broth (NB) untuk penyegaran kultur bakteri uji dan media Nutrien Agar (NA) untuk pemeliharaan kultur dan penumbuhan bakteri uji. Peralatan yang digunakan dalam penelitian dikelompokkan menjadi tiga bagian yaitu: (1) alat untuk persiapan bahan seperti pisau, oven pengering, plastik tahan panas, timbangan kasar; (2) alat untuk ekstraksi terdiri atas tabung erlenmeyer, timbangan analitik, shaker Innova 2300 new brunswick scientific, rotavapor BUCHI R210, filter vakum BUCHI B169 vacuum system, lemari pendingin, penangas air, gas nitrogen, oven, freeze dry; (3) alat untuk persiapan kultur mikroba uji dan uji antimikroba yaitu meliputi otoklaf, vortex, mikroskop, hot plate, sudip, cawan petri, tabung reaksi berulir, timbangan analitik, inkubator suhu 37 o C, bunsen dan spiritus, mikropipet 10 100 µl dan 100 1000 µl. B. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Pusat Antar Universitas (PAU) Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor dari bulan Juni 2010 hingga bulan Juli 2011. C. METODE PENELITIAN Secara garis besar, penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan. Tahap pertama meliputi persiapan kultur bakteri uji dan persiapan serbuk jahe kering. Tahap kedua yaitu ekstraksi dengan maserasi bertingkat menggunakan pelarut heksan, etil asetat dan etanol. Tahap ketiga meliputi pengujian aktivitas antimikroba berupa pengukuran diameter daya hambat ekstrak jahe dengan metode difusi sumur serta pengujian aktivitas penghambatan dengan metode dillution broth. Tahapan penelitian digambarkan sebagai berikut (Gambar 10). 14
Rimpang jahe gajah segar Persiapan kultur bakteri uji Serbuk jahe kering Ekstraksi heksan Ekstrak non polar Residu Ekstraksi etil asetat Residu Ekstraksi etanol Ekstrak semi polar Ekstrak polar Freeze dry Uji aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumur Antimikroba aktivitas tertinggi Residu Gambar 10. Diagram alir tahap penelitian Pengujian aktivitas penghambatan bakteri uji dengan beberapa konsentrasi dengan metode dillution broth 1. Persiapan kultur bakteri uji Persiapan kultur bakteri uji terlebih dahulu dilakukan pewarnaan Gram sederhana untuk mengetahui keseragaman kultur bakteri uji dan perhitungan total kultur bakteri uji menggunakan metode Aerobic Plate Count (APC) untuk mengetahui jumlah total bakteri awal sehingga dapat dihitung pengenceran yang diperlukan agar kultur yang digunakan pada saat pengujian berkisar 10 5 CFU/ml dengan menggunakan media NA. Pewarnaan Gram digunakan untuk identifikasi anggota dari domain bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Tahap pewarnaan Gram sederhana dilakukan diatas preparat kaca, yaitu kultur disebar membentuk lapisan tipis diatas preparat kaca, dikering-udarakan, dilewatkan diatas api untuk fiksasi, diwarnai dengan pewarnaan Gram, dicuci dan dikeringkan. Selanjutnya morfologi sel bakteri uji dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 1.000x. Sel bakteri dengan morfologi berwarna violet merupakan bakteri Gram-positif, sedangkan sel bakteri dengan morfologi berwarna merah merupakan bakteri Gram-negatif (Madigan et al., 2003). Tahap persiapan kultur bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 11. Sebanyak 1 ose bakteri uji ditumbuhkan dalam media NB 10 ml dan diinkubasi 24 jam pada suhu 37 o C. Kultur bakteri ini digunakan sebagai kultur kerja pada setiap pengujian. Suspensi bakteri ditumbuhkan dengan menggunakan media NA pada seri pengenceran 10 4 10 8 dan diinkubasi 24 jam pada suhu 37 o C. Koloni bakteri dengan jumlah 25 250 yang tumbuh dihitung berdasarkan metode Aerobic Plate Count (APC) (BAM, 2001) dengan rumus sebagai berikut: Jumlah koloni (CFU/ml) = N = jumlah koloni pada cawan (25 250) ( n 0,1 n ) d 1 + 2 Keterangan: n = jumlah cawan d = pengenceran pada cawan pertama 15
Kultur bakteri uji dlm agar miring diambil 1 ose Diinkubasi 37 o C 24 jam 10 ml NB steril Kultur kerja 10-1 10-2 10-3 10-4 9 ml pengencer steril 1 ml 10-5 @ 1 ml 10-6 @ 1 ml 10-7 @ 1 ml 10-8 @ 20 ml NA steril Diinkubasi 24 jam suhu 37 o C dan diamati Gambar 11. Tahap persiapan kultur bakteri uji 2. Persiapan serbuk jahe kering Persiapan rimpang jahe kering mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Undriyani (1987) yaitu rimpang jahe segar dicuci hingga bersih dan ditiriskan, kemudian diiris tipis dengan slicer ketebalan 1,5 mm, dikeringkan dengan oven pengering pada suhu 55 o C selama 5 jam sampai kering, selanjutnya dihaluskan dengan blender dan diayak dengan ukuran 20 mesh hingga didapatkan serbuk halus. Rendemen serbuk jahe kering dihitung berdasarkan pada persentase antara bobot serbuk jahe yang didapatkan dengan bobot rimpang jahe awal yang digunakan (Gambar 12). Rimpang jahe segar Dicuci bersih, ditiriskan Diiris tipis (Slicer 1,5 mm) Dikeringkan dengan oven (55 o C) sampai kering Diblender kering Diayak ukuran 20 mesh Gambar 12. Tahap persiapan serbuk jahe Serbuk jahe kering 3. Ekstraksi jahe dengan maserasi bertingkat Tahap ekstraksi mengacu pada metode yang digunakan oleh Parhusip (2006) dengan modifikasi pada suhu pemekatan yaitu serbuk jahe sebanyak 100 g diekstrak dengan metode 16
maserasi bertingkat menggunakan tiga jenis pelarut yaitu masing-masing dengan heksan, etil asetat dan etanol. Serbuk jahe diekstrak dua kali masing-masing dengan heksan 400 ml, selanjutnya residu diekstrak dua kali masing-masing dengan etil asetat 400 ml dan selanjutnya residu kedua diekstrak dua kali masing-masing dengan etanol 400 ml. Proses ekstraksi dilakukan pada suhu ruang dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 24 jam setiap tingkat. Tiap-tiap filtrat dipisahkan dari pelarut dengan cara penguapan dalam rotavapor. Pelarut pertama dan kedua diuapkan pada suhu 50 o C dan pelarut ketiga diuapkan pada suhu 70 o C. Sisa pelarut dihilangkan dengan gas nitrogen. Rendemen ekstrak jahe yang didapatkan dihitung sebagai persentase ekstrak (mg ekstrak jahe setelah rotavapor/ 100 g serbuk jahe kering). Setelah itu dikeringkan dengan freeze drier untuk menghilangkan kadar air dalam ekstrak. Ekstraksi serbuk jahe dengan berbagai jenis pelarut dapat dilihat pada Gambar 13. 100 g serbuk jahe kering Dimaserasi (heksan 400 ml) Ulangan Ampas Filtrat Ulangan Ampas Dimaserasi (etil asetat 400 ml) Filtrat Dipekatkan 50 o C dengan rotavapor Dihembuskan gas N 2 Ulangan Dimaserasi (etanol 400 ml) Dipekatkan 50 o C dengan rotavapor Ekstrak heksan Ampas Filtrat Dihembuskan gas N 2 Dipekatkan 70 o C dengan rotavapor Ekstrak etil asetat Dihembuskan gas N 2 Ekstrak etanol Gambar 13. Ekstraksi jahe dengan maserasi bertingkat 4. Pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumur Pengujian aktivitas antimikroba mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Shan et al. (2007). Tujuan tahap ini adalah untuk mengetahui aktivitas antimikroba dari ekstrak heksan, etil asetat dan etanol terhadap B. cereus, S. aureus dan S. Typhimurium. Masing-masing ekstrak jahe dilarutkan dalam DMSO. Sebagai media pertumbuhan digunakan media NA. Sebanyak 20 ml agar diinokulasikan dengan kultur bakteri yang mengandung bakteri uji sebanyak 10 5 CFU/ml. Selanjutnya dibuat 5 sumur pada media agar tersebut dengan diameter sumur 5 mm ketebalan 4 mm secara aseptis menggunakan alat pelubang agar steril. Kemudian setiap sumur dimasukkan 60 µl larutan ekstrak jahe konsentrasi 100 mg/ml, kontrol positif (kloramfenikol 100 µg/ml air steril) dan kontrol negatif (DMSO). Setelah ditetesi dengan ekstrak jahe, cawan diinkubasi dengan posisi tidak dibalik pada suhu 37 o C 17
selama 24 jam. Aktivitas penghambatan dihitung berdasarkan diameter penghambatan terhadap bakteri uji yang membentuk zona bening dan diukur menggunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,05 mm. Tahap ini dilakukan secara duplo dengan tiga kali ulangan. Zona penghambatan (d = 2r) yang diukur adalah diameter zona bening dikurangi dengan diameter sumur. Semakin lebar diameter penghambatan, maka aktivitas senyawa antimikroba semakin besar. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas penghambatan terkuat akan dipilih untuk tahap penelitian selanjutnya. Tahap pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumur dapat dilihat pada Gambar 14. 20 ml NA cair Diinokulasi dengan bakteri uji berkisar 10 5 CFU/ml Dibuat sumur diameter ± 5 mm e a b Keterangan: a,b,c = ekstrak jahe konsentrasi 100 mg/ml DMSO (heksan, etil asetat, etanol) d c d= kloramfenikol100µg/ml air steril (w/v) (kontrol positif) e= pelarut DMSO (kontrol negatif) @ sumur ditetesi 60 µl ekstrak dengan konsentrasi 100 mg ekstrak/ml @ sampel bakteri uji duplo dan ulangan 3x Diinkubasi suhu 37 o C 24 jam Diukur diameter penghambatan dengan jangka sorong (diameter zona bening dikurangi dengan diameter sumur) Gambar 14. Pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumur 5. Pengujian aktivitas penghambatan dengan metode dillution broth Pengujian aktivitas penghambatan mengacu pada Radiati (2002) dengan metode dillution broth menggunakan media NB. Pengujian aktivitas penghambatan dilakukan pada ekstrak jahe yang memiliki aktivitas antimikroba tertinggi terhadap bakteri uji. Konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 0, 5, 10, 15, 20 mg/ml untuk bakteri uji yang menunjukkan penghambatan pada difusi sumur. Kisaran konsentrasi mengacu pendekatan yang dilakukan oleh Radiati (2002) yang menemukan bahwa pada kisaran konsentrasi tersebut terdapat konsentrasi hambat minimal (MIC) untuk bakteri uji yaitu dengan menggunakan ekstrak semi-polar (diklorometan) yang diperoleh dari maserasi bertingkat dapat menghambat bakteri S. Typhi sebesar 10 mg/ml. Tahap pengujian aktivitas penghambatan dapat dilihat pada Gambar 15 yaitu ekstrak jahe terpilih dibuat larutan stok sebesar 40 % (mg ekstrak/ ml DMSO) ditambah ke dalam tabung berisi inokulum bakteri uji yang mengandung campuran antara media NB. Selanjutnya kultur diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Subkultur ditumbuhkan pada media NA pada inkubasi 0 jam dan setelah inkubasi 24 jam dengan kisaran pengenceran antara 10 3 10 8. Perhitungan konsentrasi ekstrak etil asetat menggunakan rumus: 18
M 1 V 1 = M 2 V2 Keterangan: M 1 = 40 % (larutan stok stok) (mg/ml DMSO) V1= volume ekstrak yang ditambahkan (ml) M2= konsentrasi ekstrak yang dikehendaki (mg/ml) V2= volume total saat inkubasi (10 ml) Penghitungan jumlah ekstrak etil asetat 40% yang diambil untuk mendapatkan masingmasing volume ekstrak sebagai berikut (Tabel 9): Contoh: M 2 = 5 % 40 % x V1= 5 % x 10 ml V1= 1,25 ml Tabel 9. Kombinasi konsentrasi pengujian aktivitas penghambatan metode dillution broth Konsentrasi Ekstrak yang Kultur (ml) NB (ml) Volume total saat ekstrak % (M 2 ) ditambahkan inkubasi (ml) (ml) (V1) (V 2 ) 5 1,25 1 7,75 10 10 2,50 1 6,50 10 15 3,75 1 5,25 10 20 5,00 1 4,00 10 Keterangan: V NB = V 2 V kultur V 1 (ml) Penurunan jumlah pertumbuhan bakteri ditentukan dengan menghitung persentase selisih jumlah koloni yang tumbuh setelah 24 jam dengan jumlah koloni yang tumbuh pada 0 jam dibagi jumlah koloni yang tumbuh pada 0 jam. Nilai konsentrasi ekstrak jahe yang menunjukkan penurunan jumlah bakteri sebesar 90 % merupakan nilai konsentrasi hambat minimal (MIC). Ekstrak terpilih Dilarutkan dalam DMSO Ditambahkan dalam media NB Konsentrasi ekstrak jahe yang ditambahkan (mg/ml) 0 5 10 15 20 Diinokulasi dgn bakteri uji s.d @tabung 10 5 CFU/ml Diinkubasi 37 o C 24 jam Ditumbuhkan dalam cawan dengan pengenceran antara 10 3-10 8 Diamati Ditumbuhkan dalam cawan dengan pengenceran antara 10 3-10 8 Diamati Gambar 15. Pengujian aktivitas penghambatan dengan metode dillution broth 19