II. METODOLOGI PENELITIAN 2.1. Metode Pengumpulan Data 2.1.1. Tempat dan waktu penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana, sedangkan uji inokulasi pada tanaman kacang kedelai dalam kantong polybag dilakukan di rumah kaca Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Penelitian ini dilaksanakan selama tiga bulan yaitu pada bulan November 2012 sampai dengan bulan Februari 2013. 2.2. Metode Penelitian 2.2.1 Bahan penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar), MB (Metilen Blue), media YMB (Yeast Extract Mannitol Broth), alkohol 70%, air steril, biji kedelai, dan media tanam (tanah). 2.2.2. Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari cawan Petri, jarum ose, botol steril, mikroskop listrik, inkubator, pisau, oven, Bunsen, hot plate, timbangan mikro, kulkas, autoclave, polybag. 2.2.3. Pembuatan media YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) Untuk pembuatan media YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) bahan yang digunakan terdiri dari mannitol 10 gram, K2HPO4 0,5 gram, MgSO47H2O 6
0,2 gram, agar 20 gram, NaCl 0,1 gram, ekstrak yeast 1 gram, dan akuades 1 liter dicampur hingga homogen, kemudian ditambahkan 1% MB (Metilen Blue) dan dipanaskan diatas penangas air sambil diaduk-aduk hingga mendidih. Setelah itu disterilisasi dengan Autoclave pada temperatur 121 0 C dengan tekanan 15 lbs. (Parmana, 2010). 2.2.4. Pembuatan media YMB (Yeast Extract Mannitol Broth) Untuk pembuatan media YMB (Yeast Extract Mannitol Broth) bahan yang yang digunakan terdiri dari manitol 10 gram, K2HPO4 0,5 gram, MgSO47H2O 0,2 gram, NaCl 0,1 gram, ekstrak yeast 1 gram, dan akuades 1 liter dicampur hingga homogen dan dipanaskan diatas penangas air sambil diaduk-aduk hingga mendidih. Setelah itu disterilisasi dengan Autoclave pada temperatur 121 0 C dengan tekanan 15 lbs. (Parmana, 2010). 2.2.5. Isolasi nodul Tanaman kacang kedelai diambil dari persawahan didaerah Desa Pinda, Kecamatan Gianyar, Kabupaten Gianyar dengan cara membuat lubang pada tanah yang ditumbuhi tanaman kedelai, kemudian tanaman kedelai tersebut diangkat berlahan agar nodulnya tidak lepas dari akarnya. Setelah didapatkan tanaman kacang kedelai kemudian tanaman kedelai tersebut dimasukan kedalam kantong plastik. Akar tanaman kacang kedelai yang berisi nodul dicuci dengan air atau dibersihkan dari tanah yang melekat. Nodul yang telah di pisahkan dari akar kemudian dicuci dengan air steril dan dibilas dengan alkohol 95% dan di bilas kembali ke air steril. Nodul yang telah steril di tetesi air steril kemudian di pencet 7
sehingga cairan merah keluar dari nodul dan cairan merah tersebut di tanam ke dalam cawan petri yang berisi media YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) + MB (Metilen Blue) dengan cara streak. Inkubasi cawan Petri di dalam inkubator dengan suhu 28 0 C selama 24-48 jam (Somasegaran and Hoben, 1994). Hal tersebut dilakukan hingga memperoleh kultur murni yang ditandai koloni Rhizobium sp. berwarna biru. Bakteri yang didapat diidentifikasi menggunakan buku Bergye,s Manual Determinative Bacteriology (1994). 2.2.6. Pembuatan kultur starter Rhizobium sp. Pembuatan kultur starter Rhizobium sp. dilakukan dengan cara kultur murni dari Rhizobium sp. dipindahkan kedalam 50 ml media YMB (Yeast Extract Mannitol Broth) dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan pada api bunsen untuk mendapatkan kultur starter. Kemudian diinkubasi pada shaker dalam kondisi digoyang dengan suhu 28 0 C (Parmana, 2010). 2.2.7. Kondisi pertumbuhan Kultur starter ditumbuhkan kedalam 250 ml labu erlemeyer yang diisi 50 ml media YMB (Yeast Extract Mannitol Broth) (ph 7,0). Kultur starter diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28 0 C diatas shaker dengan kecepatan 70 rpm dan kemudian diinokulasi kembali pada media YMB (Yeast Extract Mannitol Broth) dengan ph 5,8 dan ph 7,0 (Kawuri, 1997). 2.2.8. Ketahanan terhadap asam (Acid Tolerance Response) Untuk menguji respon toleransi terhadap asam pada Rhizobium sp., 5 ml sel kultur starter yang ditambahkan 50 ml media YMB (Yeast Extract Mannitol 8
Broth) (ph 7,0) disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 15 menit pada suhu kamar. Kemudian terjadi pemisahan antara residu dengan supernatan. Supernatan dibuang dan residu yang mengendap dibilas dengan media steril YMB (ph pertumbuhan 7,0). Selanjutnya ditambahkan dengan 50 ml media YMB dengan ph 5,8 dan ph 7,0, kemudian diinkubasi diatas shaker dengan kecepatan 70 rpm. Diambil 1 ml masing-masing sampel setiap 2 jam sekali secara berkala selama 24 jam untuk melihat pertumbuhan bakteri dengan menggunakan platting method (Kawuri, 1997). 2.2.9. Persiapan kultur Rhizobium sp. untuk in vivo Diambil 100 ml kultur starter Rhizobium sp., yang berpotensi terhadap kondisi asam, kemudian dimasukan ke dalam 250 ml labu elenmeyer dan kemudian diinkubasi selama 1 hari diatas shaker. Setelah diinkubasi kemudian dibandingkan dengan standart Mc Farland 5% dimana dengan kisaran jumlah bakteri 1x10 8 sel/ml (Somasegaran and Hoben, 1994) 2.2.10. Persiapan media tanam Tanah yang digunakan diambil dari persawahan di daerah Pinda, Kecamatan Gianyar, dengan kedalaman 10 cm. Penggunaan tanah tersebut karena tanah yang berada di daerah Pinda, Kecamatan Gianyar memiliki ph rendah (5,0). Tanah yang didapatkan kemudian dikeringkan dan dibersihkan dari sisa-sisa akar tanaman dan kotoran lain, kemudian tanah tersebut dihancurkan dan diayak. Tanah yang sudah kering dan bersih disterilisasi dengan menggunakan autoclave 9
pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Tanah yang telah disterilisasi dimasukkan ke dalam polybag. 2.2.11. Uji ketahanan Rhizobium sp. pada tanah asam (ph 5,0) secara in vitro Untuk menguji ketahanan Rhizobium sp. pada tanah asam (ph 5,0), ditimbang 90 gram tanah (ph 5,0) dan ditambahkan dengan 1 ml kultur starter yang tahan asam (ph 5,8). Kemudian diinkubasi selama 20 hari. Setiap harinya dihitung total bakteri dengan menggunakan platting method dengan pengenceran yang disesuaikan. Setelah membeku diinkubasi dengan suhu 28 0 C selama 24 jam. Perhitungan total bakteri dilakukan setiap hari selama 28 hari. 2.2.12. Uji inokulasi pada tanaman Sebelum dilakukan uji inokulasi pada tanaman, kultur starter yang telah dibandingkan dengan standart Mc Farland 1x10 8 sel/ml terlebih dahulu dilakukan pengenceran (10-1 -10-9 ). Kemudian diambil 3 biji kedelai, lalu direndam selama 5 menit dalam 10 ml kultur starter + larutan tween 1 %. Selanjutnya ditanam kedalam polybag yang telah berisi media tanam (tanah), dan diulang sebanyak 4 kali, maka diperoleh 4 polybag tiap pengenceran. Setelah 8 minggu diamati pertumbuhan nodul pada akar tanaman kacang kedelai. Ada tidaknya nodul pada akar tanaman kacang kedelai dihitung dengan menggunakan metode perhitungan MPN dengan rumus. X = m x d v 10
Keterangan : X = Banyaknya rhizobia per gram tanah m = Jumlah total nodul dan dicocokan pada table MPN d = Faktor pengenceran yang terendah v = Volume aliqout yang diaplikasikan pada tanaman (Somasegaran and Hoben, 1994). 11