II. METODE PENELITIAN A. Materi, Waktu dan Lokasi Penelitian 1. Materi Penelitian Bahan yang akan digunakan meliputi ikan plati, kultur mikroorganisme yang diisolasi dari asinan sawi, Paramaecium sp., Aeromonas hydrophila, media De Mann Rogosa Sharpe Agar (MRSA, Oxoid) dan De Mann Rogosa Sharpe Broth (MRSB, Oxoid), Pseudomonas Aeromonas Selective Agar (PASA, Oxoid), alkohol 70 %, jerami, akuades, garam fisiologis 0,85 %, methanol, larutan giemsa. Alat yang digunakan meliputi akuarium, labu Erlenmeyer 250 ml (Schott Duran, Germany, beaker glass 1000 ml (IWAKI Pyrex, Japan), tabung reaksi (IWAKI Pyrex, Japan), cawan petri, drugalsky, pipet seukuran 1 ml (IWAKI Pyrex, Japan), filler, spatula, jarum inokulasi, kompor gas (Rinnai ), timbangan analitik tipe EO 2140 (Ohaus Co., USA), kulkas standar (National model B22AF), autoclave model HL36AE (Hirayama Manufacturing Corporation, Japan), inkubator, pembakar spirtus, pisau bedah, gunting, mikroskop, pipet tetes, tabung reaksi, rak tabung, gelas objek, plastic wrap, gelas ukur, penyumbat tabung, rak tabung, penyaring, kamera digital, pinset. 2. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai Maret 2014 sampai dengan bulan Mei 2014. Penelitian dilakukan di Laboratorim Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. B. Rancangan Percobaan Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga perlakuan dan diulang sebanyak tiga kali. Data diambil pada hari ke 0, 7, dan 21. Perlakuan yang dicobakan adalah pemberian pakan komersil dan pakan tambahan yang berbeda setiap perlakuan. Dengan demikian hewan perlakuan dikelompokkan sebagai : IP 0 : Ikan plati diberi pakan komersil 3 % dari bobot tubuh ikan IP 1 : Ikan plati diberi pakan komersil 3 % dari bobot tubuh ikan dan probiotik 5
IP 2 : Ikan plati diberi pakan komersil 3 % dari bobot tubuh ikan dan Paramaecum sp. yang diberi pakan probiotik C. Variabel Penelitian Variabel yang diamati yaitu variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas berupa macam pakan yang diberikan pada ikan percobaan. Adapun variabel tergantungnya adalah populasi bakteri intestinal serta imunitas ikan. Parameter utama yang diukur adalah jumlah bakteri asam laktat dan total bakteri intestinal serta gambaran darah (perhitungan persentase ragam jenis leukosit). Parameter pendukungnya yaitu persentase ikan yang bertahan hidup pada uji tantang dengan bakteri Aeromonas hydrophilla. D. Cara Kerja 1. Kultur Pakan Alami Protozoa Media pertumbuhan yang akan digunakan untuk menumbuhkan protozoa adalah air rebusan jerami. Jerami dibersihkan dengan air mengalir kemudian direbus hingga mendidih. Setelah dingin disaring, airnya ditampung dalam botol kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C dan tekanan 1 atm untuk mematikan semua organisme. Bibit protozoa yang diambil di perairan sawah dimasukan ke dalam media yang sudah steril. Diinkubasi di ruangan gelap pada suhu ruang dan diamati pertumbuhannya setiap 3 hari selama 15 hari. Selanjutnya dilakukan pemurnian dengan cara menyeleksi protozoa yang akan ditumbuhkan pada media steril yang baru sehingga didapatkan jenis Paramaecium sp. yang murni. 2. Isolasi Probiotik Probiotik diisolasi dari yoghurt. Sekitar 1 ml yoghurt diencerkan dengan 9 ml akuades steril hingga pengenceran 10-5, 2 pengenceran terakhir diplating duplo pada media cawan MRSA kemudian diinkubasi 2 x 24 jam. Pengujian dilakukan berdasarkan uji biokimiawi (katalase, uji oksidase), pewarnaan gram, dan pengamatan morfologi untuk identifikasi kultur mikroorganisme yang diinginkan. 6
3. Persiapan Akuarium Akuarium berukuran 50 x 30 x 30 cm yang digunakan sebanyak 6 unit yang telah dibersihkan dan diisi air. Air yang digunakan adalah air yang telah diendapkan selama 24 jam dengan volume air 6 liter, dilengkapi dengan aerasi selama beberapa jam kemudian ikan plati sebanyak 26 ekor dimasukkan ke dalam masing-masing akuarium. 4. Pemeliharaan Ikan Uji dan Pemberian Pakan Ikan plati yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai ukuran panjang berkisar antara 2-3 cm, berat basah 1-2 gram, dan dalam keadaan sehat serta telah diaklimasi selama 1 minggu untuk menyesuaikan diri dengan lingkungan dalam kondisi laboratorium. Ikan diberi pakan komersial 2 kali per hari (pagi dan sore), diberi pakan suplemen sesuai dengan masing-masing perlakuan 1 kali per hari. Selain itu, diukur suhu air setiap hari menggunakan termometer. 5. Persiapan Pakan Suplemen (Paramaecium sp. + Probiotik) Isolat probiotik hasil isolasi disuspensi sebanyak 1 ose pada larutan garam fisiologis 0,85% hingga diperoleh 10 8 sel per ml (melalui perhitungan langsung di haemositometer). Kemudian suspensi yang berisi 10 8 sel per ml dicampur pada media air rebusan jerami yang berisi Paramaecium sp. selama 10 jam. 6. Perhitungan Jumlah Populasi Bakteri Asam Laktat dan Total Bakteri Intestinal dengan Metode Total Plate Count (TPC) (Lay, 1994) Metode TPC diterapkan untuk menghitung jumlah populasi bakteri asam laktat dan total bakteri intestinal pada ikan. Perhitungan ini dilakukan pada hari ke 0, 7 dan 21 dari masing-masing perlakuan diambil 5 sampel ikan. Sampel intestin ikan plati ditumbuk dan diencerkan dalam larutan garam fisiologis steril 0,85 % dengan perbandingan 1 : 9, dikocok hingga homogen dan dilakukan pengenceran kembali hingga diperoleh 3 seri pengenceran dengan metode pour plate. Dua seri pengenceran terakhir diambil sebanyak 1 ml dan dilakukan plating pada cawan petri kemudian dituangkan ke dalam cawan petri tersebut medium MRSA. Hasil pour plate diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37 o C. Selanjutnya dengan cara yang sama dilakukan pengenceran hingga 4 seri pengenceran, dua pengenceran terakhir dilakukan plating dengan medium NA, diinkubasi selama 2x24 jam pada 7
suhu ruang. Koloni yang tumbuh dihitung kemudian digunakan rumus sebagai berikut : Jumlah sel = jumlah koloni cawan1,2,3,... dst x 1 fp Jumlahcawan Keterangan : fp = faktor pengenceran Jumlah sel dinyatakan dalam CFU per ml 7. Preparasi Apusan Sel Darah pada Glass Slide (Wulangi, 1993) Bagian ujung gelas objek dibersihkan dari kotoran dan lemak menggunakan alkolhol. Perbatasan antara ekor dan badan ikan plati dipotong, ditunggu sampai darah keluar kemudian diapuskan pada objek glass dengan kecepatan konstan. Preparat difiksasi dengan metanol ± 5 menit. Sisa metanol dibuang dan preparat diwarnai dengan larutan Giemsa. Preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat yang sudah kering kemudian diperiksa menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali, kemudian dihitung persentase jenis leukosit, yaitu monosit, limfosit, dan neutrofil. 8. Pengujian Tingkat Ketahanan Hidup dengan Uji Tantang Bakteri Patogen Pengujian ketahanan hidup dilakukan dengan uji tantang menggunakan bakteri patogen ikan Aeromonas hydrophila. Setelah dipelihara pada kolam selama 21 hari, 5 ekor ikan dari masing-masing perlakuan diambil untuk diuji tantang. Uji tantang dilakukan dengan pemberian A. hydrophila pada level infektif (10 6 sel per ml) dengan cara disuntikkan sekitar 0,1 ml pada masing-masing ikan perlakuan, kemudian ikan dipelihara hingga tiga minggu kemudian dalam kondisi akuarium tanpa aerasi. Diamati jumlah ikan yang mati setiap hari. Dihitung presentase ikan yang bertahan hidup. 8
E. Bagan Alir Persiapan Alat dan Bahan Pembuatan medium Sterilisasi Kultur pakan alami protozoa dan isolasi probiotik Pembuatan medium Sterilisasi Pembuatan pakan suplemen (Paramaecium sp. yang diberi pakan probiotik) Persiapan akuarium Pemeliharaan ikan uji Pemberian pakan sesuai perlakuan Perhitungan jumlah populasi mikroba intestinal Preparasi apusan sel darah putih Uji tantang dengan bakteri Aeromonas hydrophilla Data penelitian Analisis Data F. Metode Analisis Metode analisis yang digunakan adalah menggunakan analisis variansi (ANOVA) satu arah, hasil dengan nilai p < 0,05 dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil (BNT) untuk mengetahui hubungan antar perlakuan. 9