BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen dengan perlakuan ekstrak biji pepaya (Carica papaya, L.) terhadap ketebalan lapisan endometrium dan kadar hemoglobin tikus putih (Rattus norvegicus, L.). B. Pelaksanaan Penelitian 1. Waktu Penelitian Pendahuluan telah dilaksanakan pada tanggal 1 November-1 Desember 2016 dan Uji Sesungguhnya telah dilaksanakan pada tanggal 1 Januari 1 Februari 2017. 2. Tempat a. Pembuatan ekstrak biji pepaya (Carica papaya, L.) dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM. b. Pemeliharaan tikus dilakukan di Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium Biologi FMIPA UNY. c. Pembuatan preparat histologi organ dilakukan di Laboratorium Patologi dan Anatomi FK UGM. d. Pengamatan preparat histologi endometrium dilakukan di Laboratorium Mikroskopi Jurdik BIOLOGI FMIPA UNY. C. Objek Penelitian 1. Populasi Penelitian 1
Tikus putih betina galur Wistar umur 2 bulan dengan berat badan ± 150 gram. 2. Sampel Penelitian Sampel yang digunakan adalah 20 ekor tikus yang sudah dibagi menjadi 4 kandang dengan berat tubuh ± 150 gram yang diberi ekstrak biji papaya yang memiliki variasi kadar 300 mg/150grambb tikus/hari, 350 mg/150grambb tikus/hari, dan 400 mg/150grambb tikus/hari. D. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Variabel bebas dari penelitian ini berupa variasi dosis ekstrak biji pepaya. 2. Variabel Tergayut a. ketebalan lapisan endometrium tikus b. kadar hemoglobin per mm darah. 3. Kondisi Terkontrol Kondisi kontrol penelitian yaitu berat badan tikus, jenis kelamin, pemeliharaan tikus, pakan, minuman, kandang, lama pemeliharaan, umur, waktu pemberian ekstrak. E. Alat dan Bahan 1. Alat a. Kandang tikus k. Mikroskop b. Kawat strimin penutup l. Mikrometer 2
c. Spluit 3 ml m. Bak Parafin d. Sarung tangan n. Flakon e. Tempat minum tikus o. Dissecting Set f. Microtube p. Alat pengukur kadar Hb g. Timbangan q. Pipet Tetes h. Hematokrit r. Cotton Buds i. Object Glass s. Kamera j. Cover Glass t. Label 2. Bahan a. Tikus Putih Betina g. Pakan AD 1 b. Ekstrak biji papaya h. Kloroform c. Aquades i. Giemsa d. Metanol 0,1% j. Larutan Formalin 10% e. Alkohol 70% k. HCl 0,1% f. EDTA l. NaCl 0,9% F. Prosedur Kerja 1. Tahap Persiapan a. Menyiapkan tikus putih sebanyak 20 ekor dengan bobot dan umur yang sama (berat badan rata-rata 150 gram dan umur 2 bulan). b. Menyiapkan kandang tikus sebanyak 4 kandang. c. Menyiapkan biji pepaya. d. Melakukan ektraksi biji pepaya di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM. 3
2. Pembuatan Estrak Biji Pepaya a. Mengoven biji pepaya hingga kering atau hingga kadar airnya habis. b. Menghaluskan simplisia kering dari biji pepaya menggunakan mesin penggiling. c. Memasukkan biji pepaya yang sudah halus ke dalam maserator dan dituangi dengan etanol 96 % sampai terdapat selapis cairan di atas simplisia. d. Melakukan proses maserasi dengan cara perendaman selama 24 jam. e. Menampung cairan hasil ekstraksi dan sisa ampas simplisia direndam kembali dengan etanol 96% dan dibiarkan selama 24 jam. f. Menampung kembali cairan hasil meserasi dan melakukan meserasi kembali pada sisa simplisia hingga didapat tiga cairan hasil meserasi dari simplisia. g. Mengevaporasi seluruh hasil meserasi tersebut menggunakan alat evaporator sehingga didapat ekstrak kental yang terpisah dari pelarut etanolnya. 3. Aklimatisasi a. Membagi tikus ke dalam 4 kandang yang telah disiapkan dengan cara diacak sehingga diperoleh 5 ekor tikus untuk setiap kandang. 4
b. Memberikan pakan dan minum satu kali sehari. c. Membersihkan kandang 3 kali sehari dengan mengganti alas tidur dengan serbuk gergaji yang baru. d. Aklimatisasi dilakukan selama 7 hari. 4. Penentuan Dosis Penentuan dosis perlakuan pada penelitian ini didasarkan pada hasil uji pendahuluan, di mana pada uji pendahuluan terdiri dari 4 kelompok perlakuan. Satu kelompok kontrol yaitu 0 mg ekstrak biji pepaya dan tiga kelompok perlakuan, masing-masing 100 mg, 200 mg/150grambb tikus/hari, dan 300 mg/150grambb tikus/hari ekstrak biji pepaya. Berikut hasil uji pendahuluan adalah sebagai berikut: Tabel 1. Rata-rata Ketebalan Lapisan Endometrium Tikus Putih (µm) Uji Pendahuluan Perlakuan Endometrium Kontrol P1 (100mg) P2 (200 mg) P3 (300 mg) Kanan 719.62 493.05 350.5 550 Kiri 538.65 587.1 342 540.05 Tabel 2. Rata-rata Kadar Hemoglobin Tikus Putih (gr/dl) Uji Pendahuluan Perlakuan Kadar Hemoglobin Kontrol ( 0 mg) 11,3 P1 (100 mg) 10,1 P2 (200 mg) 10,4 P3 (300 mg) 12 5
Hasil uji pendahuluan di atas menunjukkan, dosis yang berpengaruh pada ketebalan dan kadar hemoglobin secara optimal adalah dosis perlakuan P3 (300 mg/150grambb tikus/hari), maka dari itu peneliti menaikkan dosis untuk penelitian selanjutnya menjadi 300 mg/150grambb tikus/hari, 350 mg/150grambb tikus/hari dan 400 mg/150grambb tikus/hari ekstrak biji pepaya. 5. Pemberian Ekstrak Biji Pepaya Sebelum tikus diberi perlakuan ekstrak biji papaya dilakukan ulas vagina terlebih dahulu untuk mengetahui siklus estrus tikus. Apabila tikus dalam keadaan estrus maka pemberian ekstrak biji pepaya dilakukan secara oral dengan menggunakan disposable syringe. Waktu pemberian ekstrak biji pepaya adalah siang hari jam 10.00 WIB. Ekstrak biji pepaya diberikan selama 21 hari. 6. Ulas Vagina Ulas vagina dilakukan pada awal sebelum dan setelah tikus mendapatkan perlakuan yaitu pada pertama dan hari ke 22. Apabila tikus dalam masa estrus maka langsung dilakukan pembedahan. Adapun prosedur apus vagina adalah gelas objek dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan alkohol 70%. Kemudian cutton bud kecil dicelupkan ke dalam garam fisiologi (NaCl 0,9%) kemudian dimasukkan ke dalam vagina tikus kira-kira 1 cm dengan diputar secara perlahan satu arah tanpa diulangi kearah yang berlawanan. Cutton bud dioleskan di atas gelas objek dengan 6
gerakan satu arah putaran. Kemudian diwarnai dengan menggunakan giemsa 10% selama 15 menit. Setelah itu, dicuci dengan menggunakan air mengalir dan dikering anginkan. Sediaan ulas vagina kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya. 7. Pengambilan Darah dan Perhitungan Kadar Hemoglobin a. Mengambil darah dari sinus orbital mencit menggunakan mikrohematokrit (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988: 108). b. Darah yang diambil ditampung di dalam mikrotube yang telah diberi Ethylen Diamin Tetra-acetic Acid (EDTA) sebagai antikoagulan (25 mg/1,5 ml darah). c. Menyimpan sementara di almari pendingin. d. Prosedur pemeriksaan dengan metode Sahli: 1). HCl 0,1 N 2). Aquadest 3). Pipet hemoglobin 4). Alat Sahli 5). Pipet pastur 4). Pengaduk e. Memasukkan HCl 0,1 N ke dalam tabung Sahli sampai angka 2. f. Mengisap darah dengan pipet hemoglobin sampai melewati batas, lalu membersihkan ujung pipet ke tisu agar darah sampai di batas angka 2. 7
g. Memasukkan pipet yang berisi darah ke dalam tabung hemoglobin, sampai ujung pipet menempel pada dasar tabung. h. Meniup pelan-pelan. Usahakan agar tidak timbul gelembung udara. Bilas sisa darah yang menempel pada dinding pipet dengan cara menghisap HCl dan meniupnya lagi sebanyak 3-4 kali. i. Mendiamkan selama kurang lebih 3-5 menit. j. Memasukan aquades tetes demi tetes sampai warna larutan (setelah diaduk sampai homogen) sama dengan warna gelas dari alat pembanding. k. Membaca kadar hemoglobin pada skala tabung, bila sudah sama. 8. Pembedahan Tikus a. Membius tikus dengan cara memasukkannya ke dalam toples berisi kapas yang telah dibasahi dengan menggunakan kloroform. b. Melakukan pembedahan menggunakan discetting set, selanjutnya mengambil organ ovariumnya, setelah tikus dibius. c. Memasukkan organ uterus dengan segera ke dalam flakon yang berisi larutan formalin 10% 9. Pembuatan Preparat Pembuatan preparat histologik dilakukan di laboratorium Patologi dan Anantomi FK UGM dengan menggunakan metode 8
parafin dan pewarnaan Hematoxylin-Eosin (HE). Langkahlangkahnya sebagai berikut: a. Fixation Uterus yang telah dilabeli dimasukkan ke dalam fixative, yaitu formalin 10%. b. Trimming Triming adalah tahapan yang dilakukan setelah proses fiksasi dengan melakukan pemotongan tipis jaringan setebal kurang lebih 4 mm. c. Dehydration (Pengeringan) Dehidrasi jaringan dimaksudkan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan, dengan meggunakan cairan dehidran yaitu alkohol secara bertingkat dengan waktu yang tertentu yaitu: 1) Alkohol 80%, selama 2 jam 2) Alkohol 96%, selama 2 jam 3) Alkohol 96%, selama 1 jam 4) Alkohol absolut, selama 1 jam 5) Alkohol absolut, selama 1 jam 6) Alkohol absolut, selama 1 jam d. Clearing (Penjernihan) 9
Proses ini bertujuan untuk menghilangkan alkohol, agar parafin dapat masuk ke dalam jaringan. Agen penjernihan adalah Xylol dengan cara bertahap yaitu : 1) Xylol, selama 1 jam 2) Xylol, selama 1 jam 3) Xylol, selama 1 jam e. Parafination Proses infiltrasi dilakukan didalam oven (incubactor) dengan perbandingan xylol : paraffin = 1:1 selama 120 menit pada suhu 60 0 C. Pemberian paraffin murni pada suhu 60 0 C selama 120 menit. Pemberian paraffin murni pada suhu 60 0 C selama 120 menit. f. Embedding (Penanaman) Jaringan yang berada pada parafin kemudian dilekatkan pada balok kayu ukuran 3x3 cm atau embedding cassette. Fungsi dari balok kayu atau embedding cassette adalah untuk pemegang pada saat blok dipotong dengan microtom. g. Sectioning (pemotongan menggunakan mikrotom) 1) Blok parafin yang telah berisi jaringan, diiris menggunakan scalpel sehingga bagian yang akan diiris dengan microtom berbentuk segiempat teratur. Preparat diletak di tengah, kira-kira 3-5 mm dari tepinya. 10
2) Meletakkan blok parafin pada holder kayu. 3) Memasang holder dengan blok paraffin pada rotary microtom yang direkatkan. 4) Menyiapkan tempat coupes atau pita preparat dan kuas kecil untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom. 5) Mengatur tebal tipisnya coupes dengan mengatur pada pengaturan di microtom. 6) Memasukkan preparat kedalam nampan yang berisi air hangat. Hal tersebut dilakukan agar coupes dapat merentang dan jaringan tidak melipat. 7) Menempelkan Coupes pada gelas benda (pada proses affixing) yang sebelumnya telah diolesi oleh putih telur atau albumin. h. Affixing 1) Meletakkan sejumlah coupes (irisan tengah pita preparat) pada kaca benda yang telah diberi perekat dengan gliserin dan albumin. 2) Memindahkan kaca-kaca gelas benda yang berisi coupes tersebut ke atas hot plate dengan suhu (40-45 C), adanya kelebihan air dihisap dengan menggunakan pipet/kertas saring, dan mengarur letak coupes dengan parafinnya direntangkan. i. Pewarnaan menggunakan Hematoxylin-Eosin 11
1) Mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes ke dalam xylol secara berulang yaitu: Xylol (I) selama 5 menit, Xylol (II) selama 5 menit, dan Xylol (III) selama 5 menit. 2) Melakukan dehidrasi berulang yakni: Alkohol absolute (I) selama 5 menit, Alkohol absolut (II) selama 5 menit. 3) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 1 menit. 4) Mencelupkan ke dalam Hematoxyilin-Eosin selama 20 menit. 5) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 1 menit. 6) Mencelupkan coupes ke dalam acid alkohol sebanyak 2-3 celupan. 7) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 1 menit. 8) Mencelupkan coupes ke dalam aquadest selama 15 menit. 9) Mencelupkan kedalam Eosin selama 2 menit 10) Melakukan dehidrasi berulang lagi yakni: Alkohol 96% (I) selama 3 menit, Alkohol 96% (I) selama 3 12
menit, Alkohol absolut (III) selama 3 menit, Alkohol absolut (IV) selama 3 menit. 11) Mecelupkan ke dalam Xylol yaitu : Xylol (IV) selama 5 menit, Xylol (V) selama 5 menit 12) Memounting dengan per mount. 10. Pengamatan Histologik Preparat yang sudah jadi diamati di bawah mikroskop cahaya dan dengan bantuan mikrometer okuler dan objektif dengan perbesaran 40X. Preparat diamati pada seluruh bidang pandangnya, lalu membandingkan hasil yang diperoleh antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Cara mengukur ketebalan lapisan endometrium diukur mulai dari lapisan yang berbatasan langsung dengan lumen uterus sampai dengan batas antara lapisan endometrium dengan lapisan miometrium menggunakan bantuan mikrometer okuler yang telah dikalibrasi dengan mikrometer objektif. Hasil hitungan kalibrasi mikrometer okuler dengan mikrometer objektif adalah sebagai berikut: 7 okuler = 80 µm 1 okuler = 80 : 7 = 11.4 µm 13
Ketebalan endometrium yang telah diketahui dikalikan dengan nilai kalibrasi 11.4, maka akan ditedapatkan ketebalan endometrium pada setiap bagian (atas, bawah, kanan dan kiri). G. Teknik Penempatan Sampel Teknik ini perlu dilakukan untuk membagi tikus secara acak yang akan dimasukkan ke dalam masing-masing kandang. Teknik yang digunakan adalah pengambilan tikus secara acak, yaitu dengan pemberian warna merah dan hijau menggunakan spidol permanen di badan tikus. Warna serta kode tersebut adalah: merah, hijau, merah merah, hijau hijau dan merah hijau. Warna dan kode tersebut akan digunakan untuk mengisi masing-masing kandang, sehingga setiap kandang terisi 5 ekor tikus dengan warna dank ode yang telah dibuat tersebut. Tabel 3. Pembagian Warna pada Tikus Putih sebagai Teknik Melakukan Pemilihan Sampel Tikus Warna dan Kode Tikus Warna dan Kode 1 Merah (M) 11 Merah (M) 2 Hijau (H) 12 Hijau (H) 3 Merah Merah (MM) 13 Merah Merah (MM) 4 Hijau Hijau (HH) 14 Hijau Hijau (HH) 5 Merah Hijau (MH) 15 Merah Hijau (MH) 6 Merah (M) 16 Merah (M) 7 Hijau (H) 17 Hijau (H) 8 Merah Merah (MM) 18 Merah Merah (MM) 9 Hijau Hijau (HH) 19 Hijau Hijau (HH) 10 Merah Hijau (MH) 20 Merah Hijau (MH) 14
H. Teknik Pengumpulan Data Pengumpulan data yang dilakukan adalah dengan pengamatan masing-masing preparat ketebalan endometrium menggunakan mikroskop dan mikrometer okuler dan objektif, kemudian melakukan penghitungan ketebalan endometrium. Penghitungan kadar hemoglobin dilakukan dengan menggunakan alat pengukur Hb pada hari ke-28. I. Teknik Analisis Data Data yang diperoleh merupakan data kuantitatif dari hasil pengamatan dan penghitungan ketebalan endometrium serta kadar hemoglobin tikus putih yang telah diberi perlakuan, yaitu pemberian ekstrak biji papaya dengan dosis yang berbeda. Data yang diperoleh dari penghitungan ketebalan endometrium dan kadar hemoglobin dianalisis menggunakan Analisys of Varians (ANOVA) satu arah (One Way Anova) untuk mengetahui pengaruh dari pemberian ekstrak biji pepaya yang berbeda dosisnya pada taraf signifikan p<0,05. Uji lanjut Duncan s Multiple Range Test (DMRT) taraf uji 5% untuk mengetahui beda nyata antar perlakuan, apabila hasil analisis ANOVA signifikan Data diuji menggunakan bantuan programn Statistical Package for Social Sciens ver (SPSS) 2016. 15