BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian ini adalah eksperimen satu faktor dengan pola acak lengkap. Dosis uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan dosis uji sesungguhnya. Dosis uji pendahuluan menggunakan 3 kelompok perlakuan dan 1 kali kontrol dengan masing-masing kelompok 3 ekor tikus putih. Pemberian ekstrak daun kenari dengan volume 3 ml perhari sesuai dengan dosis sebagai berikut : 1. P0 : 0 mg/ekor/hari 2. P1 : 100 mg/ ekor /hari 3. P2 : 200 mg/ ekor /hari 4. P3 : 300 mg/ ekor /hari Tabel 3. Rata-rata jumlah folikel ovarium uji pendahuluan Jumlah Folikel P0 P1 P2 P3 Folikel Primer 1,6 2,6 2,6 3,3 Folikel Sekunder 2,6 3,0 4,0 4,3 Folikel Tersier 6,0 7,0 8,6 8,0 Folikel De graff 4,0 5,6 6,0 4,0 Ovulasi 1,3 2,3 2,6 2,0 Corpus luteum 5,6 7,0 8,6 8,3 Folikel atresia 2,6 4,3 5,6 6,0 43
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 P0 (Kontrol) P1 (100) P2 (200) P3 (300) Primer Sekunder Tersier De Graff Ovulasi Corpus luteum Atresia Gambar 14. Diagram Rata-rata jumlah folikel ovarium uji pendahuluan B. Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimen dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Dengan menggunakan 3 kelompok perlakuan dan 1 kali kontrol dengan masing-masing kelompok 5 ekor tikus putih. Pemberian ekstrak daun kenari dengan volume 4 ml perhari sesuai dengan dosis masing-masing perlakuan secara oral yang didasarkan pada hasil uji pendahuluan yaitu sebagai berikut : P0 P1 P2 P3 : 0 mg/ ekor /hari : 200 mg/ ekor /hari : 300 mg/ ekor /hari : 400 mg/ ekor /hari C. Waktu dan Tempat Penelitian 1. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober - November 2016. 44
2. Tempat Penelitian a. Pembuatan ekstrak daun kenari dilakukan di Laboratorium Farmasi Unit II UGM dengan teknik ekstrasi maserasi. b. Pemeliharaan tikus dilakukan di Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium Biologi FMIPA UNY. c. Pembuatan preparat histologik organ dilakukan di Laboratorium Patologi FKH UGM. d. Pengamatan preparat histologik folikel ovarium dilakukan di Laboratorium Mikroskopi Biologi FMIPA UNY. D. Populasi dan Sampel 1. Populasi Tikus putih betina umur 2 bulan dengan berat badan 150-200gram. 2. Sampel 16 ekor tikus putih betina yang diberi pelakuan ekstrak daun kenari. E. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Ekstrak uji daun kenari dengan dosis perlakuan : P0 P1 P2 P3 : 0 mg/ekor /hari : 200 mg/ ekor/hari : 300 mg/ ekor/hari : 400 mg/ ekor/hari 45
2. Variabel Tergayut Struktur histologik perkembangan folikel ovarium yaitu jumlah folikel primer, sekunder, tersier, de graaf, corpus luteum, atresia, dan ovulasi. F. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat a. Kandang tikus b. Temapat pakan dan minum tikus c. Alat suntik ukuran 5ml d. Botol jam e. Botol flakon f. Sarung tangan g. Sonde oral h. Cotton buds j. Mikroskop k. Bak parafin l. Alat bedah m. Gelas preparat n. Alat ekstrasi maserasi o. Alat tulis p. Mikrotom q. Nampan i. Kertas label 2. Bahan a. Tikus betina umur ±2 bulan b. Alkohol 70%, 80% dan 90% absolute c Pakan Tikus d. Formalin 10% e. Chlorofom f. Aquadesh j. Garam fisiologis k. Serbuk gergaji l. Daun kenari m. Xylol n. Toluol o. Haematoxylin p. Glyserin q. Etanol 96% 46
g. Pewarna Eosin h. Parafin i. Pewarna giemsa 47
G. Langkah Penelitian 1. Tahap persiapan a. Menyiapkan 16 tikus putih betina umur ±2 bulan dengan berat 150-200 gram. b. Menyiapkan kandang tikus sebanyak 4 buah. c. Menyiapkan daun kenari. d. Melakukan ekstrasi daun kenari dengan teknik maserasi di Laboratorium Farmasi Unit II UGM. 2. Tahap pembuatan ekstrak daun kenari dengan teknik maserasi. Daun kenari yang sudah kering dihancurkan menjadi bentuk serbuk, kemudian massa yang telah halus dimasukkan kedalam maserator dan ditambahkan dengan etanol 96% sampai terdapat selapis cairan penyari hasil rendaman. Proses maserasi yang dilakukan dengan cara perendaman dibiarkan selama 24 jam. Cairan hasil ekstrasi ditampung dan sisa ampas direndam kembali dengan etanol 96% dan dibiarkan selama 24 jam. Cairan hasil maserasi ditampung kembali dan dilakukan kembali maserasi pada sisa serbuk daun hingga didapat tiga cairan hasil maserasi. Seluruh hasil maserasi tersebut dievaporasi menggunakan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental yang terpisah dari pelarut etanolnya. 3. Aklimatisasi a. Menyiapkan 16 ekor tikus putih (Rattus norvegicus, L.) berumur ±2 bulan. 48
b. Menyiapkan 4 buah kandang dan memasukkan tikus putih secara acak sebanyak 4 ekor tikus kedalam masing-masing kandang. c. Memberikan pakan dan minum tikus setiap hari. d. Membersihkan kandang 3 kali seminggu dengan mengganti alas berupa serbuk gergaji. e. Tahap aklimatisasi berlangsung selama 7 hari di Unit Pengelolaan Hewan Biologi. 4. Perhitungan dosis a. Perhitungan Dosis Penentuan dosis perlakuan pada penelitian didasarkan pada hasil uji pendahuluan, dimana pada uji pendahuluan terdiri dari 4 kelompok perlakuan. Satu kelompok kontrol (0 mg ekstrak daun kenari) dan tiga kelompok perlakuan, masing-masing 100mg, 200mg, 300mg ekstrak Berdasarkan hal uji pendahuluan, dosis yang berpengaruh terhadap perkembangan folikel ovarium adalah pada dosis perlakuan P2 (200mg). Berdasarkan besar dosis tersebut, pada penelitian ini ditentukan 4 kelompok perlakuan, yaitu 1 kelompok kontrol (0 mg ekstrak daun kenari) dan 3 kelompok perlakuan P1(200mg), P2 (300mg) dan P3 (400mg). Dari 1000 gram daun kenari dihasilkan 17,17 gram ekstrak daun kenari. 1 gram berat kering =, = 0,017 gram Dalam 1 gram mengandung 0,017 gr ekstrak. 49
Dalam 15 gram ekstrak daun kenari mengandung flavonoid 2,624 gr Quersetin/ekuivalen a. Perlakuan 200mg/ekor/hari 0,2 gr X 4 Tikus X 21 hari = 16,8 gr b. Perlakuan 300mg/ekor/hari 0,3 gr X 4 Tikus X 21 hari = 25,2 gr c. Perlakuan 400 mg/ekor/hari 0,4 gr X 4 Tikus X 21 hari = 33,6 gr 5. Tahap pelaksanaan a. Pemberian ekstrak daun kenari Ekstrak daun kenari diberikan secara oral pada tikus sesuai dosisnya selama 21 hari sebanyak 4 ml (2 ml pada pukul 9.00 dan pukul 15.00 WIB). b. Pemeliharaan dengan pemberian pakan pakan AD 2 secara rutin setelah pemberiak ekstrak daun kenari. c. Pengambilan apus vagina dilakukan untuk mengetahui siklus estrus pada awal saat tikus akan mendapat perlakuan dan sesudah tikus mendapatkan perlakuan. Adapun prosedur pembuatan apus vagina adalah gelas obyek dibersihkan dengan alkohol 70%. Cotton bud dicelupkan ke dalam NaCl fisiologis,kemudian dimasukkan kedalam vagina tikus sedalam 1 cm. Kemudian diputar secara perlahan-lahan dan merata sehingga diperoleh jaringan mukosa vagina. Cotton bud yang mengandung mukosa vagina selanjutnya dioleskan diatas gelas 50
obyek sambil diputar sehingga diperoleh olesan yang merata. Gelas obyek selanjutnya dikering anginkan kemudian difiksasi dengan menggunakan methanol 70% selama 15 menit dan ditetesi dengan methilen blue selama 15 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan pada suhu kamar. Sediaan apus vagina selanjutnya diamati dibawah mikroskop. Penentuan fase siklus estrus dilakukan berdasarkan keberadaan sel-sel epitel vagina dan jumlah kualitatif sel-sel epitelnya. d. Melakukan pembedahan dan pembuatan preparat histologik ovarium pada tikus putih yang didalamnya mencakup perkembangan folikel. e. Pembuatan preparat histologik Dilakukan pembedahan terhadap tikus putih pada hari ke-21 pada saat fase estrus kemudian dibedah dan diambil organ ovariumnya direndam dalam formalin 10%. Pemuatan preparat dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan UGM dengan cara kerja sebagai berikut : 1) Tikus dimatikan terlebih dahulu dengan cara dibius dengan menggunakan kloroform. 2) Sectio (pembedahan) Pembedahan pada hewan yang telah mati untuk pengambilan organ yang akan digunakan sebagai preparat yaitu ovarium tikus putih. 3) Labeling (Pemberian label) Ovarium dimasukkan ke dalam botol flakon dan diberi label. 51
4) Fixation Ovarium yang telah diberi label kemudian langsung dimasukkan kedalam fixative, agar tidak terjadi autolisis post mortal. Dalam hal ini fiksative yang digunakan adalah larutan formalin 10%. 5) Dehydration (Pengeringan) Dehidrasi adalah mengganti molekul air dengan molekul alkohol bertingkat dari konsentrasi rendah hingga absolute dengan waktu tertentu : a) Alkohol 70% 3x@30 menit b) Alkohol 80% 3x@30 menit c) Alkohol 90% 3x@30 menit d) Alkohol 96% 2x@30 menit e) Alkohol absolute, 1x@30 menit 6) Clearing (Penjernihan) Proses ini bertujuan untuk menghilangkan alkohol agar parafin dapat masuk kedalam jaringan. Dalam pembuatan preparat folikel ovarium ini agen penjernihan yang digunakan adalah toluol, hal ini dimaksudkan agar preparat ini tetap lunak, walaupun lama berada didalam zat ini namun preparat tidak mengalami kerusakan. 7) Paraffination (Pemasukan parafin) Proses infiltrasi dilakukan didalam oven (incubator) dengan temperatur 70-80ºc. Hal ini dimaksudkan agar temperaturnya cocok untuk pengisian parafin selama proses ini agar jaringan tidak rusak. 52
Paraffin yang dipilih untuk pembuatan preparat ini adalah paraffin yang mempunyai titik leleh yang tidak terlalu merubah keadaan sitologik dan sitokimianya. Proses ini dilakukan dengan memakai paraffin bertingkat, yaitu paraffin : toluol dengan perbandingan 1 : 1, paraffin murni 1, paraffin murni 2, paraffin murni 3 masing-masing selama 30 menit. Pengisian paraffin tergantung dari tebal tipisnya pemotongan preparat yang digunakan.paraffin dibiarkan hingga memadat, serta blok diberi label arah pemotongan dan nama jaringan. 8) Sectioning (Pemotongan Dengan Mikrotom) a) Blok paraffin yang berisi jaringan tadi diiris dengan scalpel, sehingga bagian yang akan diiris dengan pisau mikrotom berbentuk segiempat teratur. Diiris sedemikian rupa sehingga preparat terletak pada bagian tengah caupes (irisan tengah pita preparat) kira-kira 3-5 mm dari tepinya. b) Blok paraffin diletakkan pada holder kayu dengan mencairkan sedikit paraffin pada holder agar dapat melekat. c) Lalu holder dengan blok paraffin dipasang pada rotary mikrotom yang direkatkan. d) Setelah dipasang pada holder,dipersiapkan tempat coupes (pita preparat) dan kaus kecil untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom. 53
e) Jika sudah lengkap persiapannya, pisau mikrotom dipasang pada tempatnya dimikrotom dan direkatkan. f) Diatur tebal tipisnya coupes, pada preparat ini diatur 6 mikron. g) Setelah diiris segera ditempelkan pada gelas benda (pada proses affixing) 9) Affixing a) Sejumlah coupes diletakkan pada kaca benda yang telah diberi perekat dengan albumin, lalu ditetesi aquadest secukupnya. b) Kaca-kaca kemudian dipindahkan diatas hotplate yang panas (40-45ºc), letak coupes diatur dan paraffinya direntangkan, kelebihan air dihisap menggunakan pipet. c) Kaca benda dibiarkan diatas hotplate sampai kering ±1 hari. 10) Pewarnaan hematoxylin eosin Langkah pertama adalah melakukan deparafinnasi dengan mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes ke dalam xylol selama 30 menit. Selanjutnya melakukan proses pewarnaan menggunakan Hematoxylyn-Eosin. a) Setelah proses penghilangan parrafin, coupes dikeringkan dari xylol mengguanakan kertas filter maupun tissue, selanjutnya melakukan rehidrasi berturut-turut dengan mencelupkan ke dalam alkohol absolute, alkohol 96%, 90%, 80%, 70% kemudian memasukkan dalam eosin selama 2 menit, mencelupkan ke dalam alkohol 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 54
kemudian dicelupkan ke dalam Hematoxylyn selama 10 menit dan mencucinya menggunakan air mengalir. b) Menetesi slide dengan Canada Balsam. 11) Penutup Setelah ditetesi mengguanakan Canada Balsam kemudian objek gelas ditutup dengan gelas penutup dan diusahakan tidak muncul gelembung, karena adanya gelembung akan mengganggu pengamatan. 12) Pengamatan struktur histologik Preparat histologik uterus yang telah dibuat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40X. Preparat diamati seluruh bidang pandangnya, kemudian membandingkan hasil yang diperoleh antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Cara menghitung jumlah folikel ovarium adalah dengan mengamati preparat ovarium di bawah mikroskop, kemudian menghitung jumlah keseluruhan folikel ovarium yang terdapat di lapisan ovarium tersebut. Jumlah keseluruhan folikel ovarium tersebut meliputi folikel primer, folikel sekunder, folikel tersier, folikel de graff, ovulasi, corpus luteum dan folikel atresia. 55
H. Teknik Sampling Pengambilan sample tikus putih betina dilakukan dengan Purposive Random Sampling, dengan kriteria umur ±2 bulan. Enam belas ekor tikus putih betina tersebut dibagi menjadi 4 kelompok dengan cara random sampling, tiap kelompok terdiri atas 4 ekor tikus putih. Subjek pada penelitian ini dibagi menjadi 4 kelompok secara acak yang masing-masing kelompok berjumlah 4 ekor tikus putih. Kelompok 1 sebagai kelompok kontrol sedangkan kelompok 2, 3 dan 4 sebagai kelompok perlakuan. I. Teknik Pengumpulan data Penelitian diakhiri pada hari ke-21 dan tikus di eutanasi untuk diambil organ ovariumnya, kemudian dilakukan proses preparasi dan dibuat preparat organ ovarium dengan pengecatan HE. Pengumpulan data melalui pengamatan pada preparat oavrium yang telah dibuat dan diambil dokumentasinya kemudiann dihitung jumlah folikel ovariumnya pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan ekstrak daun kenari, keseluruhan hasil pengamatan kemudian dianalisis. J. Analisis Data Data jumlah folikel ovarium dianalisis menggunakan analisis nonparametrik kruskal-wallis untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh pemberian ekstrak daun kenari terhadap perkembangan folikel ovarium antara kelompok kontol dengan kelompok perlakuan (200mg/ekor/hari, 300mg/ekor/hari, 400mg/ekor/hari) analisis secara statistik dengan bantuan SPSS 16. 56