10 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan mulai dari bulan Februari 2012 sampai Mei 2012. Penderaan fisik benih, penyimpanan benih, dan pengujian mutu benih dilakukan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih, Departemen Agronomi dan Hortikultura. Analisis kandungan antosianin dilakukan di Laboratorium Molekular Marker dan Spektrofotometer UV-VIS, Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB. Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kacang tanah varietas Kelinci, Kancil, Bison, dan Tuban yang memilki ukuran benih dan kandungan antosianin berbeda. Bahan lainnya yaitu kertas merang, kertas label, aquades, plastik, kain strimin, dan bahan kimia untuk analisis antosianin yaitu asetris. Alatalat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mesin pengusangan cepat (MPC) fisik, alat pengecambah benih IPB 72-1, alat pengepres kertas IPB 75-1, oven untuk penetapan kadar air dan mengeringkan kecambah normal, timbangan, desikator, pipet, cawan porselen, tabung reaksi, dan spektrofotometer UV-Vis. Metode Penelitian Penelitian terdiri atas dua percobaan. Percobaan 1 pengaruh pengusangan cepat terhadap viabilitas benih kacang tanah dan pembuatan lot benih dengan cara mendera benih dalam mesin pengusangan cepat fisik dengan suhu tinggi dan RH tinggi. Percobaan 2 pengaruh penyimpanan alami terhadap viabilitas benih kacang tanah dan pembuatan lot benih dengan cara menyimpan benih secara alami dalam ruangan bersuhu kamar. Rancangan Penelitian Rancangan yang digunakan untuk kedua percobaan yaitu Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor dengan empat taraf perlakuan yaitu pengusangan selama 0, 24, 48, dan 72 jam pada percobaan 1 dan dan penyimpanan selama 0, 1,
11 2, dan 3 bulan pada percobaan 2. Setiap taraf perlakuan diulang sebanyak tiga kali, sehingga masing-masing percobaan terdiri dari 48 satuan percobaan. Model umum rancangan percobaan ini adalah : Yij = μ + άi + εij Yij = pengamatan pada perlakuan ke-i, dan ulangan ke-j. μ = rataan umum άi = pengaruh dari perlakuan ke-i εij = pengaruh galat percobaan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis sidik ragam (uji F). Apabila hasil analisis sidik ragam menunjukkan pengaruh yang nyata, maka pengujian dilanjutkan dengan Uji Wilayah Berganda Duncan (DMRT) pada taraf 5%. Uji-t dilakukan untuk mengetahui perbedaan ukuran benih dan kandungan antosianin. Analisis regresi dan korelasi dilakukan untuk mengetahui hubungan antar tolok ukur pada pengusangan cepat dengan penyimpanan alami. Pelaksanaan Penelitian Percobaan 1 Pengaruh Pengusangan Cepat Terhadap Viabilitas Benih Beberapa Varietas Kacang Tanah Pengusangan cepat dilakukan dengan menggunakan empat varietas kacang tanah. Setiap varietas kacang tanah diusangkan secara fisik dan diuji viabilitasnya pada waktu yang berbeda. Benih diletakkan dalam mesin pengusangan cepat fisik dengan suhu 43 C dan RH 100 % selama 24. 48, dan 72 jam. Pada perlakuan pengusangan 0 jam, benih langsung diuji kadar airnya dan diuji viabilitasnya. Sedangkan untuk perlakuan 24, 48, dan 72 jam, benih kacang tanah dari masingmasing varietas dimasukkan ke dalam kain strimin sebanyak 225 butir untuk pengujian viabilitas dan vigor benih, dan 18 butir untuk pengujian kadar air. Benih yang digunakan untuk masing-masing varietas sebanyak 243 butir untuk satu taraf perlakuan, sehingga benih yang dibutuhkan dalam percobaan 1 sebanyak 972 butir.
12 Pengujian kadar air benih dilakukan dengan metode langsung menggunakan oven. Jumlah benih yang digunakan sebanyak 6 butir kacang tanah untuk setiap ulangan yang diiris terlebih dahulu. Benih kemudian dimasukkan ke dalam cawan alumunium dan dioven pada suhu 105 C selama 17 ± 1 jam. Setelah dioven benih dikeluarkan dan disimpan di dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang. Pengecambahan benih dilakukan menggunakan metode Uji Kertas Digulung dalam plastik (UKDdp). Benih diuji viabilitasnya dengan mengecambahkan pada media kertas merang berbentuk segi empat panjang berukuran 20 cm x 30 cm direndam dalam air, setelah basah secara merata ditiriskan airnya dengan menggunakan alat pengepres kertas IPB 75-1. Benih ditanam di atas 3 lembar media kertas merang yang di bawahnya dilapisi plastik, benih yang ditanam berjumlah 25 butir benih kacang tanah. Setelah benih ditanam, media ditutup dengan 2 lembar kertas merang yang sudah dilembabkan dan digulung, kemudian benih yang sudah digulung dikecambahkan dalam alat pengecambah benih tipe IPB 72-1. Percobaan 2 Pengaruh Penyimpanan Alami Terhadap Viabilitas Benih Beberapa Varietas Kacang Tanah Penyimpanan alami dilakukan dengan menyimpan benih dalam ruangan bersuhu 27-31 C dan RH 57-60%. Benih dikemas di dalam plastik sesuai dengan varietas masing-masing. Benih disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan. Pada perlakuan penyimpanan 0 bulan, benih langsung diuji kadar airnya dan diuji viabilitasnya. Sedangkan untuk benih yang disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan, masing-masing varietas kacang tanah dikemas didalam plastik dan disimpan. Setiap akhir periode simpan, benih dikeluarkan dari plastik sebanyak 225 butir untuk pengujian viabilitas dan vigor benih, dan 18 butir untuk pengujian kadar air untuk masingmasing varietas. Sehingga benih yang dibutuhkan untuk percobaan 2 sebanyak 972 butir. Pengujian kadar air benih dan pengecambahan benih dilakukan seperti percobaan 1.
13 Pengujian Viabiliats Benih Pengujian viabilitas benih dilakukan setelah benih didera dalam mesin pengusangan cepat dan penyimpanan alami. Parameter viabilitas benih yang diamati adalah Viabilitas Potensial (VP) dengan tolok ukur Daya Berkecambah (DB), dan Berat Kering Kecambah Normal (BKKN) dan Vigor Kekuatan Tumbuh (V KT ) dengan tolok ukur Kecepatan Tumbuh (K CT ) dan Indeks Vigor (IV). Pengujian Kandungan Antosianin Pengujian kandungan antosianin benih dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dengan menggunakan acetris sebagai absorbannya. Sampel yang digunakan adalah benih kacang tanah varietas Kelinci, Kancil, Bison, dan Tuban yang masih utuh. Bahan kimia acetris digunakan sebagai pelarut ekstraksi. Cara ekstraksinya adalah dengan memisahkan kulit kacang tanah dari embrionya lalu setiap 2 g kulit benih yang telah dihaluskan ditambahkan dengan 5 ml acetris, kemudian dimasukan ke dalam tabung reaksi dan disentrifugasi (14 000 rpm) selama 10 menit. Sebanyak 3 ml supernatan dimasukan ke dalam microtube dan selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 537 nm, 647 nm, dan 663 nm (Sims dan Gamon, 2002). Pengamatan Pengamatan yang dilakukan untuk mendeteksi viabilitas benih adalah : 1. Daya berkecambah Daya berkecambah dihitung berdasarkan persentase jumlah kecambah normal (KN) pada hari pengamatan pertama dan pengamatan kedua. Pengamatan daya berkecambah benih masing-masing varietas dari tiap ulangan dilakukan pada hari ke-5 dan hari ke-10 setelah benih dikecambahkan. Daya berkecambah dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : DB = KN I KN II X 100%
14 Keterangan: Σ KN I : jumlah kecambah normal pengamatan pertama (5 HST) Σ KN II: jumlah kecambah normal pengamatan kedua (10 HST) 2. Berat Kering Kecambah Normal BKKN diamati pada benih yang sudah menjadi kecambah normal, seluruh kecambah normal yang telah dipotong kotiledonnya dikeringkan dalam oven pada suhu 60 o C selama 3 X 34 jam. 3. Kecepatan Tumbuh Pengamatan dilakukan terhadap kecambah normal sejak hari pertama hingga hari kesepuluh setelah tanam. Pengamatan dilakukan setiap 24 jam sekali. Kecepatan tumbuh dapat dihtung dengan menggunakan rumus : KCT N t Keterangan : t = Waktu pengamatan sampai hari ke-10 (etmal) N = Persentase kecambah normal setiap waktu pengamatan n = Waktu akhir pengamatan 4. Indeks Vigor Indeks vigor diukur berdasarkan persentase kecambah normal pada hari pengamatan pertama yaitu hari ke-5 setelah benih dikecambahkan, dan dapat dihitung dengan menggunakan rumus : IV = KN X 100% Keterangan: Σ KN I : jumlah kecambah normal pengamatan pertama (5 HST) 5. Kadar Air Kadar air benih diukur dengan menggunakan 5 butir benih dari masingmasing perlakuan yang sudah dioven pada suhu 103±2 0 C selama 17±1 jam. Kadar air benih dihitung dengan menggunakan rumus:
15 KA = X 100% Pengamatan Bobot 100 Butir Benih Pengamatan bobot 100 butir benih dilakukan dengan mengambil sampel 100 butir kacang tanah untuk masing-masing varietas sebanyak 3 ulangan dan menimbang bobot sampel tersebut. Pengamatan Kandungan Antosianin Benih Kandungan antosianin diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 537 nm, 647 nm, dan 663 nm (Sims dan Gamon, 2002). Rumus perhitungan kandungan antosianin adalah sebagai berikut: Antosianin = (0.08137 x A537) - (0.00697 x A647) (0.002228 x A663). Keterangan: A537, A647, dan A663: nilai absorban pada panjang gelombang masing-masing 537 nm, 647 nm, dan 663 nm.