16 III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanah, serta Laboratorium Kimia dan Kesuburan Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian IPB. Penelitian dimulai sejak Juni hingga Desember 2010. 3.2. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan untuk membuat media IPB RI-1 adalah: pupuk Urea, Pupuk SP-36, limbah ikan teri, terasi, dedak, MSG, gula merah dan air mineral serta inokulan mikroba (Azotobacter, Azospirillum dan Bakteri Pelarut Fosfat). Jumlah inokulan yang digunakan sebanyak 2% dari volume media. Inokulan mikroba adalah koleksi Prof. Dr. Iswandi Anas, Kepala Laboratorium Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor. bahan media IPB RI-1 disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Bahan untuk Membuat 5 liter Media IPB RI-1 Jumlah (gram) Pupuk Urea 50 Pupuk SP-36 25 Limbah ikan teri 50 Terasi 12,5 Dedak 50 MSG 5 Gula merah 50 5 liter Bahan yang digunakan membuat media IPB RI-2 antara lain : molases, air mineral dan inokulan mikroba (Azotobacter, Azospirillum dan Bakteri Pelarut Fosfat) sebanyak 2% dari volume media yang dibuat. bahan media IPB RI-2 disajikan pada Tabel 6.
17 Tabel 6. Bahan untuk Membuat 5 liter Media IPB RI-2 Jumlah Molases (5%) 250 ml 5 liter Sebagai pembanding digunakan media Nutrient Broth produksi Difco. Bahan yang digunakan membuat media Nutrient Broth antara lain Nutrient Broth dan air mineral. bahan media Nutrient Broth disajikan pada Tabel 7. Tabel 7. Bahan untuk Membuat 500 ml Media Nutrient Broth Jumlah Difco Nutrient Broth 4 gram 500 ml Selain itu digunakan pula media agar antara lain : Nitrogen Free Media untuk Azotobacter, Nitrogen Free Bromthymol Blue untuk Azospirillum dan Pikovskaya untuk Bakteri Pelarut Fosfat. Hasil analisis unsur hara pada media IPB RI-1, media IPB RI-2 dan media Nutrient Broth dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8. Kandungan N, P dan K pada Media IPB RI-1, IPB RI-2 dan Nutrient Broth Media N P K % Media IPB RI-1 0,13 0,07 0,02 Media IPB RI-2 0,05 0,02 0,13 Media Nutrient Broth 0,05 0,03 0,02
18 3.3. Pelaksanaan Penelitian Metode penelitian meliputi persiapan bahan-bahan, pembiakan inokulan dalam media serta penghitungan sel mikroba dengan Metode Cawan Agar (Plate Counting) dan Metode MPN (Most Probable Number). 3.3.1. Persiapan bahan-bahan Azotobacter, Azospirillum dan Bakteri Pelarut Fosfat yang diinokulasikan ke dalam media alternatif, dibiakkan dengan menggunakan shaker selama 4 hari dengan menggunakan media Nutrient Broth. Pada media IPB RI-1, semua bahan-bahan dihaluskan lalu dicampur dalam satu wadah, lalu disaring dan kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Hal yang sama dilakukan pada media IPB RI-2. Untuk media Nutrient Broth, digunakan Nutrient Broth produksi Difco yang dilarutkan dengan 500 ml air mineral, lalu disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 3.3.2. Pembiakan Inokulan dalam Media Inokulan Azotobacter, Azospirillum dan Bakteri Pelarut Fosfat diinokulasikan ke dalam 12 galon air mineral. Wadah ini terdiri dari 6 galon yang masing-masing berisi 5 liter media IPB RI-1, dan 6 galon yang masing-masing berisi 5 liter media IPB RI-2. Hal yang hampir sama dilakukan pada media Nutrient Broth yakni dengan menginokulasikan Azotobacter, Azospirillum dan Bakteri Pelarut Fosfat ke dalam 6 erlenmeyer yang masing-masing berisi 500 ml media Nutrient Broth. Setelah itu tiap media diberikan perlakuan yakni dengan diberikan aerasi dan tidak diberikan aerasi. Jumlah semua biakan yang dibuat adalah 18 biakan, disajikan pada Tabel 9.
19 Tabel 9. Media, Mikroba dan Perlakuan Aerasi pada Media No. Kode /Nama Media Nama Bakteri Aerasi 1 IPB RI-1 Azotobacter Ya 2 IPB RI-1 Azotobacter tanpa 3 IPB RI-1 Azospirillum Ya 4 IPB RI-1 Azospirillum tanpa 5 IPB RI-1 Bakteri Pelarut Fosfat Ya 6 IPB RI-1 Bakteri Pelarut Fosfat tanpa 7 IPB RI-2 Azotobacter Ya 8 IPB RI-2 Azotobacter tanpa 9 IPB RI-2 Azospirillum Ya 10 IPB RI-2 Azospirillum tanpa 11 IPB RI-2 Bakteri Pelarut Fosfat Ya 12 IPB RI-2 Bakteri Pelarut Fosfat tanpa 13 Nutrient Broth Azotobacter Ya 14 Nutrient Broth Azotobacter tanpa 15 Nutrient Broth Azospirillum Ya 16 Nutrient Broth Azospirillum tanpa 17 Nutrient Broth Bakteri Pelarut Fosfat Ya 18 Nutrient Broth Bakteri Pelarut Fosfat tanpa Azotobacter, Azospirillum dan Bakteri Pelarut Fosfat ditumbuhkan pada media IPB RI-1, IPB RI-2 dan Nutrient Broth dalam wadah air mineral yang telah dimodifikasi. Wadah air mineral dijadikan sebagai fermentor dan untuk perlakuan pemberian aerasi, udara yang steril dialirkan dengan menggunakan pompa akuarium dengan laju alir 1-2 liter/menit. Aerasi berfungsi sebagai penyuplai oksigen untuk sel mikroba. Laju oksigen yang disuplai ke dalam media dijaga stabil. Fluktuasi laju alir oksigen dapat mengganggu metabolisme sel karena oksigen terlarut tidak stabil. Selain aerasi, galon modifikasi juga dilengkapi dengan batu aerasi dan filter udara steril. Batu aerasi berfungsi sebagai pemecah gelembung-gelembung udara agar gelembung udara yang terbentuk berukuran kecil sehingga laju difusi oksigen ke dalam larutan lebih cepat dan meningkatkan kadar oksigen terlarutnya sedangkan filter udara steril berfungsi sebagai penyaring udara dari luar yang masuk ke dalam galon yang berisi media sehingga terhindar dari kontaminan mikroba lain.
20 3.3.3. Penghitungan Populasi Mikroba dengan Metode Cawan Agar (Plate Counting) dan Metode MPN (Most Probable Number) Pengambilan sampel kultur inokulan dilakukan pada hari ke-0, 5, 10 dan 15. Sebanyak 10 ml kultur diambil dari media IPB RI-1, media IPB RI-2 dan media Nutrient Broth, lalu dibuat 10 ml ke dalam 90 ml larutan fisiologi untuk membuat pengenceran 10-1 dan serial pengenceran diteruskan hingga 10-8. Sebanyak 1 ml larutan dari masing-masing seri pengenceran dipindahkan ke cawan petri yang kemudian dituang ke media yang sudah disiapkan sesuai dengan mikroba yang dihitung populasinya yaitu media NFM (Nitrogen Free Media) untuk Azotobacter dan media Pikovskaya untuk Bakteri Pelarut Fosfat. Koloni bakteri yang tumbuh diamati dan dihitung populasinya dengan menggunakan metode cawan agar (Plate Counting). Sedangkan untuk Azospirillum menggunakan media NFB (Nitrogen Free Bromthymol Blue). Koloni bakteri yang tumbuh diamati dan dihitung populasinya dengan menggunakan metode Most Probable Number. Seluruh prosedur kerja dilakukan di dalam laminar air flow secara aseptik untuk menghindari terjadinya kontaminasi.