BAHAN dan METODE PENELlTIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Patologi Balai Penelitian Perikanan Air Tawar Sukamandi. Peneiitian dilaksanakan selama lima bulan. sejak bulan Pebruari sampai Juni 2001 Bahan dan Alat Penelitian Ikan yang digunakan adalah ikan patin (Pangasius djambal) yang diperoleh dari produksi Balai Penelitian Perikanan Air Taw Sukamandi berumur 1 minggu. Ikan dikarantina selama 1 bulan' dalam fiber glass yang telah disucihamakan dengan KMn04. Pemberian pakan dilakukan 2 kati sehari. Bahan untuk imunostimulan adalah SpimZirzap2atensi.s yang diperoleh dari Laboratorium Mikroalga, Pusat Penelitian dan Pengembangan BioteknologiLIPI, Cibinong clan Lipopolisakarida (LPS) yang diekstrak dari bakteri Vibrio h~eyi produksi Balitkanwar Sukamandi. Pakan yang digunakan adalah pelet CP 781 dengan kandungan protein sebesar 35%. Pakan perlakuan dibuat dengan cara meiarutkan Spimlina platemis bentuk powder dm LPS cair ke daiarn air aquades steril sampai homogen, suspensi Spirulinaplatensis dm LPS dicarnpurkan sedikit. demi sedikit pada pakan sesuai dosis perlakuan. Pakan dikeringkan dibawah sinar matahari selama 4 5 jam. Pelet dikemas dalam kantong plastik dan disimpan dalam kulkas. Bakteri untuk uji tantang adalah bakteri Aeromonas hydrophila isolat no.26 koleksi laboratorium Patologi Balitkanwar Sukamandi. Untuk keperluan ini bakteri tersebut dibiakkan pada media TSA dan diinkubasi selama 24 jam.
Wadah yang digunakan adalah akuarium clan bak fiber yang dilengkapi peralatan aerasi. Untuk mencegah berkembangnya potogen dan membersihlcan kotoran yang menempel dalam wadah, maka sebelum digunakan wadah disuciharnakan dengan KMn04 sebanyak 5 ppm seiama 24 jam, selanjutnya dibilas dengan air bersih dan dikeringkan. Alat untuk pemerikasaan respon kekebaian adaiah jarurn suntik, tabung reaksi, obyek dan gelas penutup, hemasitometer, mikropipet, pipet pasteur, pipet berskala, tabung hematokrit kapiler. sentxifirs, alat penghitung, mikroskop, petridish, gelas beker, elemeyer, penangas air, autoklaf, jarum ose, inkubator, spektrofotometer dan kulkas. Bahan kimia untuk analisis parameter pengamatan adalah akuades, alkohol, metanol, HCl, Naslhat, pewama Giemsa, media TSA, PBS, larutan Hayem, lamtan Turks, dan Khh04 Rancangan Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimen yang terdiri atas 2 tahapan penelitian yaitu pengujian dosis Aeromonas hydrophila yang dapat menyebabkan mortalitas 50% (ID) pada ikan patin clan pengaruh Spirul~na platensis terhadap sistem kekebalan ikan patin. Pada pengujian LDm, diterapkan 4 perlakuan dosis Aeromonas hydrophila yaitu 1 03, lo5, 1 07, dan 1 o9 cfu/ml. Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 2 ulangan. Pada penelitian pengaruh Spirulina platensis terhadap siatem kekebalan ikan patin, diterapkan 5 perlakuan dosis (096, 2%, 4%, dan 6% Spirulina platensis serta 0.06% LPS sebagai kontrol positif) dengan waktu pemberian secara kontinyu (diberikan setiap hari selama 4 minggu) dan diskontinyu (dberikan dengan selang waktu 1 minggu selama 4 minggu).
Penelitian ini menggunakan rancangan acak Iengkap (RAL) pola faktorial 2x5 dengan 3 ulangan (Steel dan Torrie 1989). Adapun kombinasi perlakuan adalah sebagai berikut: Waktu pernberian 1 II A 1'4 IIA B IB IIE? Dosis C IC IIC D ID IID E IE IIE Keterangan: I = kontinyu, I1 = diskontinyu A = Wh(kontro1), 8 = 0.06% LPS (Kontrol +), C = 2% Spimlinaplatensis, D = 4% Spirulina platensis, E = 6 Oh Spirulina platensis Pelaksanaan Penelitian Pengujian LDso Aeromonas hydrophih pada Ikan Patin Ikan uji dengan bobot ratarata 12 gram dipelihara &lam akuarium dengan kepadatan I0 ekor per wad& Masingmasing ikan diinfeksikan dengan dosis Aerornonas hydrophila lo3, lo5, lo7, dan lo9 cfulml. Penginfeksian dilakukan dengan cara penyuntikan bakteri ke dalam tubuh ikan secara intra muscdar. Setelah diinfeksikan, diadakan pengamatan terhadap perkembangan gejala klinis dan jumlah mortalitas ikan uji Pengaruh SpiruCi~pZatensis terhadap Sistem Kekebalan Ikan Patin Ikan uji dengan bobot rabrata 12 14 gram dipelihara &lam bak frber dengan kepadatan 25 ekor per wadah. Ikan dipetihara selama enam minggu; pemberian pakan dilakukan 2 kali sehari sebanyak 5% bobot tubuh. Pada perlakuan dosis dengan waktu kontinyu, pakan yang mengandung Spimlina platensis dan LPS diberikan setiap hari selama empat minggu pertama
pemeliharaan; pa& pemeliharaan selanjutnya diberikan pakan CP 781 yang tidak mengandung Spirulina platensis dan LPS. Sedangkan pada perlakuan dosis dengan waktu diskontinyu, pakan yang mengandung Spirulina platensis dan LPS diberikan dengan interval waktu selang satu minggu selama empat minggu; pada pemeliharaan seianjutnya juga diberikan pakan CP 781 yang tidak mengandung SpiruIina platensis dm LPS. Penyiponan dilakukan setiap pagi hari dan dilakukan penambahan air sampai setinggi semula Pemeriksaan gambaran respon kekebalan dan hematologis ikan uji dilakukan pa& hari ke0, 7, 14, 21, 28 (setelah pemberian Spirulina platensis), 36 dan 43 (setelah uji tantang). Efektivitas proteksi imonologik dilakukan melalui uji tantang dengan penyuntikan patogen aktif Aeromonas hydrophila dengan kepadatan sesuai hasil penentuan LDSO. Uji tantang ini dilakukan pada hari ke29 setelah pemberian Spirulina platensis. Pengamatan gejala klinis dan tingkat kelangsungan hidup ikan uji dilakukan setiap hari terutama setelah dilakukan uji tantang. Pemeriksaan Parameter Penelitian Parameter yang diperiksa &lam pengujian LD50 Aerornonas 1:ydrophila pada ikan patin meliputi patofisiologi (gejala klinis dm tingkah laku ikan) serta pengamatan tingkat kelangsungan hidup ikan. Ahpun parameter yang diperiksa pada perlakuan SpiruZinuplatensis meliputi peningkatan respon seluler ikan patin (total leukosit, jenis leukosit, indeks pagositik, kadar hematokrit) dan tingkat kelangsungan hidup.
LD50 Aeromonas hydrophila pada Ikan Patin LD50 ditentukan dengan adanya tingkat mortalitas ikan 50% selama 24 jam pengamatan. Perneriksaan LDso dilakukan dengan cara menghitung persentase mortalitas ikan setelah diinfeksikan dengan Aeromonas hydrophila pada berbagai tingkat kepadatan bakteri mengikuti rumus Hazen (1978) dalam Sanusi (1988): Keterangan : M = mortalitas ikan (Oh) Nt = jumlah ikan hidup pada hari ket (ekor) No = j d a h ikan hidup pada hari keo (ekor) Pemeriksaan Respon Kekebalan Ikan Patin Pemeriksaan respon kekebalan meliputi jumlah total leukosit, jenis leukosit, dan aktivitas pagositik dan kadar hematoloit. Untuk pemeriksaan ini, pengambilan darah dilakukan sebagai berikut: darah &an diambil dari bagian kaudal dengan spuit 1 ml yang ditambahkan dengan antikoagulan ( Nasitrat 3.8% ) dengan perbandingan 1:4. Darah ikan yang telah diambil ditampung dalam tabung Efpendorfuntuk pemeriksaan selanjutnya. Penghitungan Total Leukosit Total leukosit dihitung menurut Blaxhall dan Daisley (1973), yaitu sampel darah dihisap dengan pipet pencampur) sampai skala 0.5, dilanjutkan dengan menghisap larutan Turk s sampai skala 11. Pipet digoyangkan sampai campuran homogen. Tetesan pertama dibuang, tetesan berikutnya diteteskan di hernasitometer, ditutup dengan gelas penutup kemu&an dilakukan penghitungan jumlah sel darah putih. Pengllltungan dilakukan pada 5 kotak besar hemasitometer Jumlah total leukosit = jumlah sel terhitung x 50 sevmm3
Penghitungan Jenis Leukosif Penghitungan jenis leukosit dilakukan menurut Blaxhall dan Disley (1973) yaitu dengan mengamati preparat ulas darah. Preparat ulas darah Qbuat dengan cara menempatkan setetes darah pada gelas objek yang bersih, di atas gelas objek pertama ini ditempatkan ujung gelas objek kedua membentuk sudut 45', gelas objek kedua di geser ke arah belakang menyentuh tetesan darah hingga menyebar kemudian gelas objek kedua digeser ke arah berlawanan hingga terbentuk lapisan darah yang tipis clan dibiarkan hingga kering. Selanjutnya dilakukan fiksasi dengan metanol selama 5 menit, dibiarkan kering udara dan diwarnai dengan larutan Giemsa selama 15 menit, dibilas dengan air mengalir dan dibiarkan hingga kering. Preparat diamati dibawah mikroskop dan dilakukan penghitungan jenis leukosit. Pengukuran Indeks Pagositik Pengukuran indeks pagositik untuk mengetahui aktivitas selsel pagositik Pengukuran ini dilakukan dengan metode ulasan indeks fagositik mengikuti Anderson dan Siwicki (1993), yaitu sebanyak 100 p1 darah dimasukkan ke dalam mikrotiter plat dan ditambahkan sebanyak 100 pl suspensi StaphyZZococcus aureus &lam PBS (10' sel), dicampurkan secara homogen dan diinkubasi selama 20 menit. Selanjutnya dibuat ulasan darah, dikeringkan dengan udara, difiksasi dengan metanol selama 5 menit dm diwarnai dalam larutan Giemsa selama 15 menit, dicuci dengan air mengalir dan keringkan. Preparat diamati di bawah mikroskop setiap 100 sel diukur aktifitas fogositiknya. Aktivitas pagositik didasarkan atas prosentase jumlah sel polimorfnuklear (PMN) yang menunjukkan proses pagositosis.
Kadar Hematokrit (We) Kadar hematokrit diukur mengikuti Anderson dan Siwicki (1993), yaitu Sarnpel darah dimasukkan ke tabung mikrohematokrit dengan sistem kapiler Seteiah darah mencapai 4/5 bagian tabung, kemudian ujung tabung (bertanda merah) disumbat dengan kretoseal. Tabung kapiler yang telah berisi darah di sentrifise seiama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Pengukuran kadar hematokrit dilakukan dengan membandingkan volome padatan sel darah terhadap volume seluruh darah menggunakan skala hematokrit. Kelangsungan Hidup Ikan Tingkat kelangsungan hidup ikan dihitung berdasarkan Effendi (1997) rumus sebagai berikut: Keterangan : S = tingkat kelangsungan hidup (%) N, = jumlah ikan hidup pada hari ket (ekor) No = jumlah ikan hidup pa& hari keo (ekor) Analisa Data Data pemeriksaan parameter respon kekebalan dan tingkat kelangsungan hidup ikan uji dianalisis dengan sidik ragam dan untuk mengetahui respon yang terbaik dari interaksi perlakuan terhadap parameter menggunakan uji Duncan (Steel dan Tome 1989). Data gejala klinis dianalisis secara desknptif, data disajikan dalam bentuk TabeI d m Grafik.