47 BAB III METODE PENELITIAN A. RANCANGAN PENELITIAN Penelitian ini merupakan uji klinis experimental, pretest dan posttest design. B. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian dilakukan di RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen pada bulan Oktober 2015 sampai memenuhi besar sampel. C. POPULASI PENELITIAN Populasi target penelitian ini adalah penderita PPOK. Populasi terjangkau adalah penderita PPOK eksarsebasi akut yang di rawat di RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen pada bulan Oktober 2015 sampai memenuhi besar sampel. D. PENGAMBILAN SAMPEL Sampel dalam penelitian ini adalah penderita PPOK eksarsebasi akut yang menjalani perawatan di RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen pada bulan Oktober 2015 sampai besar sampel terpenuhi. Pengambilan sampel dilakukan secara consecutive sampling. Sampel dipilih berdasarkan ciri-ciri yang telah ditentukan (memenuhi kriteria inklusi). E. BESAR SAMPEL Penentuan besar sampel tergantung jenis penelitiannya. Gay dan Diehl (1992) dalam Kasjono dan Yasril (2013) menyatakan bahwa besar sampel harus diambil sebanyak-banyaknya sesuai kemampuan penelitian dengan mempertimbangkan waktu dan energi yang wajar. Besar sampel juga disesuaikan dengan jenis penelitiannya. Besar sampel minimal yang disarankan untuk penelitian eksperimental atau uji klinis adalah 15 subjek tiap kelompok (Kasjono and Yasril 2013). Penelitian ini melibatkan 1 47
48 kelompok perlakuan dan 1 kelompok plasebo. Besar sampel minimal untuk kelompok perlakuan (mendapat vitamin C) 15 subjek dan besar sampel minimal kelompok kontrol (plasebo) adalah 15 subjek. Koreksi besar sampel untuk antisipasi drop-out sebesar: n = n/(1-f) n = Besar sampel n = Besar sampel yang dihitung f = Perkiraan proporsi drop-out (10%) n = 30/(1-0,1) n = 33,33 dibulatkan menjadi 33 Untuk penelitian ini dipakai besar sampel sebanyak 34 subjek terdiri dari 17 subjek kelompok kelompok perlakuan dan 17 subjek kelompok kontrol (Kasjono and Yasril 2013). F. KRITERIA INKLUSI, EKSKLUSI, DAN DISKONTINYU 1. Kriteria Inklusi Penderita PPOK eksarsebasi akut yang telah terdiagnosis secara klinis, umur lebih dari 40 tahun berdasarkan selisih hari kelahiran dengan ulang tahun terakhir pada saat penelitian, bersedia mengisi kuesioner dengan lengkap dan benar, serta bersedia ikut dalam penelitian dan menandatangani lembar persetujuan. 2. Kriteria Eksklusi Penderita PPOK eksarsebasi akut yang memerlukan perawatan ICU dan ventilator, menderita diare, gagal ginjal, kanker, yang menerima terapi antioksidan tambahan lain selama penelitian berlangsung, atau yang mempunyai riwayat alergi vitamin C. 3. Kriteria diskontinyu Penderita mengundurkan diri atau meninggal dunia, mengalami efek samping pemberian vitamin C antara lain gejala gastroenteritis (mual, muntah, dan diare),
49 sakit kepala selama penelitian berlangsung, mengalami penurunan fungsi ginjal sehingga memerlukan penghentian pemberian vitamin C, atau mengalami efek samping pemberian injeksi larutan NaCl 0,9 % maka pasien mengalami hipernatremia, hiperkloremia, dan hipokalemia dengan gejala yang dirasakan antara lain mual, muntah, diare, kram perut, mulut kering, mata kering, demam, berkeringat, detak jantung cepat, tekanan darah meningkat, nyeri kepala, badan lemah, kejang, dan kram otot. G. VARIABEL PENELITIAN 1. Variabel bebas: a. Pemberian vitamin C. b. Pemberian placebo (NaCl 0,9%). 2. Variabel tergantung: a. Kadar malondialdehyde (MDA) plasma. b. Lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut. H. DEFINISI OPERASIONAL 1. PPOK eksaserbasi akut yang terdiagnosis secara klinis PPOK eksaserbasi akut adalah suatu kondisi perburukan gejala penderita PPOK yang membutuhkan perubahan terapi. Penegakan diagnosis PPOK eksarsebasi akut pada penelitian ini berdasarkan klinis dan radiologis. Gejala klinis PPOK eksarsebasi didapat perburukan gejala kondisi sehari-hari berupa batuk, sesak, dan perubahan purulensi dahak. Rontgen toraks didapatkan gambaran hiperinflasi, hiperlusen, diafragma mendatar, corakan bronkovaskuler meningkat, dan jantung pendulum. 2. Vitamin C Vitamin C adalah antioksidan vitamin yang larut dalam air. L-ascorbic acid merupakan zat aktif vitamin C yang memiliki efek utama sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Vitamin C yang diberikan adalah vitamin C murni dengan merek White C produksi Fortschritt Gmbh, Austria. Vitamin C diberikan pada subjek
50 kelompok perlakuan sebanyak 1000 mg/ hari secara intravena selama hari perawatan. Kelompok kontrol tidak diberikan vitamin C, tetapi diberikan placebo berupa injeksi larutan NaCl 0,9% sebanyak 5 ml. Skala ukur : miligram Skala data : ordinal. 3. Malondialdehyde Malondialdehyde merupakan senyawa aldehid produk akhir peroksidasi lipid membran sel. Skala ukur : mikromol per mili liter (µm/ ml) Skala data : rasio. 5. Lama rawat inap Lama rawat inap merupakan lama hari pasien PPOK eksaserbasi menjalani rawat inap sampai memenuhi kriteria pemulangan. Penghitungan hari lama rawat inap dilakukan dengan cara waktu lama perawatan ditotal dalam hitungan jam dibagi 24 jam, sisanya < 12 jam dibulatkan ke bawah, tetapi jika 12 jam di bulatkan ke atas. Penghitungan lama rawat inap dimulai sejak pasien dinyatakan sebagai subjek penelitian sampai dinyatakan stabil secara klinis dan boleh pulang oleh dokter yang merawat. Kriteria pemulangan pasien adalah mampu menggunakan bronkodilator kerja panjang dengan atau tanpa steroid inhalasi, membutuhkan bronkodilator jangka pendek lebih dari tiap 4 jam, mampu bergerak sekitar ruangan, mampu makan dan minum tanpa sesak, pasien stabil secara klinis 12-24 jam, dan pasien mampu menggunakan pengobatan di rumah. Skala ukur : hari Skala data : rasio. I. INSTRUMEN PENELITIAN 1. Alat: OxiSelect TM TBARS Assay kit (MDA Quantitation) produksi Cell Biolabs Inc dengan nomor katalog STA-330, Spuit 5 ml, tabung EDTA, alat sentrifuge, mesin
51 pendingin (suhu -20 o C), ice gel, termos es, ELISA reader, spectrophotometric plate reader. 2. Bahan: Darah vena ± 5mL, assay buffer, reagen thiobarbituric acid reactive. J. PROSEDUR PENGUMPULAN DATA 1. Subjek penelitian terdiri dari penderita PPOK eksarsebasi akut yang datang ke RSUD Soehadi Pridjonegoro Sragen. Penegakan diagnosis PPOK eksaserbasi akut berdasarkan klinis dan radiologis. Gejala klinis PPOK eksarsebasi didapat perburukan gejala kondisi sehari-hari berupa batuk, sesak, dan perubahan purulensi dahak. Rontgen toraks didapatkan gambaran hiperinflasi, hiperlusen, diafragma mendatar, corakan bronkovaskuler meningkat, dan jantung pendulum. Subjek penelitian diberi penjelasan mengenai tujuan dan manfaat penelitian. 2. Subjek yang bersedia ikut penelitian diminta menandatangani lembar persetujuan (informed consent). 3. Subjek yang memenuhi kriteria inklusi diberi penjelasan, dicatat identitas, riwayat merokok, penyakit lain yang diderita, pekerjaan, di ukur tinggi badan dan berat badannya, serta lain-lain pada formulir yang disediakan. Data awal subjek diperoleh dari anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, dan rontgen toraks. Subjek kemudian diambil darah vena untuk diperiksa kadar MDA plasma serta mulai dicatat tanggal dan jam rawat inap. 4. Subjek dibagi menjadi dua kelompok secara consecutive. Kelompok pertama mendapat vitamin C 1X1000 mg/ hari yang diberikan secara intravena selama dirawat. Kelompok kedua mendapat plasebo berupa NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml secara intravena sekali sehari selama dirawat. 5. Terapi standar PPOK eksarsebasi akut (bronkodilator, kortikosteroid, antibiotik) dan terapi suportif lainnya tetap diberikan sesuai prosedur. 6. Penderita di follow-up (gejala klinis dan efek samping) dilakukan setiap hari sampai kriteria pemulangan penderita terpenuhi. 7. Penderita yang memenuhi kriteria pemulangan diambil darah vena untuk pemeriksaan kadar MDA plasma, serta dihitung lama rawat inap. Kriteria pemulangan yang digunakan terdiri dari mampu menggunakan bronkodilator kerja
52 panjang dengan atau tanpa steroid inhalasi, membutuhkan bronkodilator jangka pendek lebih dari tiap 4 jam, mampu bergerak sekitar ruangan, mampu makan dan minum tanpa sesak, pasien stabil secara klinis 12-24 jam, dan pasien mampu menggunakan pengobatan di rumah). K. TEKNIK PEMERIKSAAN 1. Sebanyak 5 ml darah vena diambil 1-2 jam setelah penderita masuk IGD sebelum penderita mendapatkan terapi standar. Darah dimasukkan dalam tabung EDTA, dibolak-balik secara perlahan, kemudian dikirim ke laboratorium patologi klinik RSUD dr. Soehadi Pridjonegoro Sragen. 2. Dilakukan sentrifuge terhadap darah vena tersebut dengan kecepatan 300 rpm selama 15 menit, kemudian diambil plasma darah hasil sentrifuge. 3. Plasma darah disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -20 o C sampai semua sampel diambil. 4. Setelah jumlah sampel terpenuhi, plasma darah dikirim ke laboratorium biomedik FK UNS dengan menggunakan termos es dan ice gel. 5. Kadar MDA plasma diukur di laboratorium Biomedik FK UNS dengan metode spektofotometrik. Prosedur pemeriksaan MDA: a. Siapkan dan campurkan semua reagen sebelum digunakan. Setiap sampel yang mengandung MDA dan standar harus diperiksa dua kali. Sampel yang mengandung kadar MDA tinggi selanjutnya dapat didilusi untuk analisis. b. Tambahkan 100 µl sampel yang tidak diketahui kadar MDA-nya atau standar MDA untuk dipisahkan pada tabung microcentrifuge. c. Tambahkan 100 µl SDS lysis Solution di kedua tabung (standar MDA dan sampel yang akan diukur). Campurkan cepat. Inkubasi sampel selama 5 menit di suhu ruangan. d. Tambahkan 250 µl reagen TBA di setiap tabung sampel dan standar MDA untuk di tes. e. Tutup masing- masing tabung dan inkubasi pada suhu 95 o C selama 45-60 menit. f. Buka tutup dan dinginkan sampai mencapai suhu ruangan dengan ice bath selama 5 menit.
53 g. Sentrifuge semua tabung sampel dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Pisahkan supernatan dari sampel untuk analisis selanjutnya. h. Pengukuran spektrofotometri dilakukan dengan mentransfer 200 µl standar MDA dan sampel ke sebuah 96 well microplate yang sesuai dengan spectrophotometric plate reader. Tambahkan 0 µm blank control. i. Pembacaan sampel dan standar dilakukan 2 kali pada panjang gelombang 523 nanometer (nm). Pengukuran juga dapat dilakukan dengan cara fluorometri. Pengukuran secara fluorometri dapat dilakukan dengan cara mentransfer sebanyak 150 µl standar MDA dan sampel ke 96 well blank fluorescence microplate yang sesuai dengan fluorometric plate reader. Ingat untuk menambahkan 0 µm blank control. Pembacaan sampel dan standar dilakukan sebanyak 2 kali pada panjang gelombang eksitasi 540 nm dan emisi 590 nm. 6. Perhitungan lama rawat inap dihitung dengan cara menjumlahkan total jam perawatan mulai saat masuk rumah sakit (MRS) sampai memenuhi kriteria pemulangan dan samapai dinyatakan boleh pulang oleh dokter. Jumlah total jam perawatan dibagi 24. Hasilnya jika < 12 jam di bulatkan ke bawah dan jika 12 jam di bulatkan ke atas. L. ETIKA PENELITIAN Persetujuan penelitian diajukan penulis ke Panitia Kelaikan Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret (FK UNS) Surakarta sebelum dilakukan penelitian. Penjelasan mengenai tujuan, manfaat, dan prosedur penelitian dijelaskan dengna rinci kepada masing-masing subjek penelitian sebelum penelitan dimulai. Subjek yang setuju dan bersedia mengikuti penelitian diminta menandatangani lembar persetujuan (informed consent) dan isian data penderita. M. ANALISIS DATA Dalam analisis data penelitian ini dinilai pengaruh pemberian vitamin C pada penderita PPOK eksarsebasi akut. Data dianalisis menggunakan program komputer SPSS 21 for Windows. Pengaruh adalah penilaian efek pemberian vitamin C terhadap kadar MDA plasma, dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut.
54 Data yang didapat diolah dengan uji beda. Uji beda digunakan untuk mengetahui perbedaan MDA plasma dan lama rawat inap antara sampel yang mendapat vitamin C dan pengobatan standar. Uji beda adalah uji statistik yang digunakan untuk mengetahui hasil perbedaan dua sampel. Analisis data perbedaan kadar MDA plasma dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut sebelum dan sesudah pemberian vitamin C atau plasebo adalah sebagai berikut: a. Data berdistribusi normal, analisis data dengan uji parametrik atau uji t-test berpasangan (kontrol: pre dan post test serta perlakuan vitamin C: pre dan post test) b. Data tidak berdistribusi normal dianalisis data dengan melakukan transformasi data terlebih dahulu. Jika data hasil transformasi berdistribusi normal maka dilakukan uji parametrik dengan uji t-test berpasangan. Jika data hasil transformasi berdistribusi tidak normal maka dilakukan uji nonparametrik untuk kelompok berpasangan yaitu dengan uji Wilcoxon (Dahlan, 2013). Menurut Dahlan (2013), analisis data untuk membandingkan kadar MDA plasma, dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut antara kelompok yang mendapat vitamin C dan plasebo menggunakan: a. Data berdistribusi normal, analisis data dengan uji t-test tidak berpasangan b. Data tidak berdistribusi normal, analisis data dilakukan uji nonparametrik untuk kelompok tidak berpasangan yaitu dengan uji Mann Whitney. Batas kemaknaan: - Nilai p > 0,05: tidak bermakna. - Nilai p 0,05: bermakna. - Nilai p < 0,01: sangat bermakna.
55 N. ALUR PENELITIAN Penderita datang di IGD PPOK eksarsebasi akut Anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, dan rontgen toraks Memenuhi kriteria inklusi Informed consent Tidak setuju ikut penelitian Setuju ikut penelitian Eksklusi Pemeriksaan kadar MDA plasma, IL-6 plasma Consecutive sampling Terapi standar + Vitamin C 1x 1000 mg Terapi standar + Plasebo Analisis statistik Penilaian perbaikan klinis dan laboratorium (Kriteria Discharge) Pemeriksaan IL-6 dan MDA plasma lama rawat inap Gambar 21. Alur penelitian hubungan pemberian vitamin C terhadap kadar MDA plasma, dan lama rawat inap penderita PPOK eksarsebasi akut. Keterangan: : alur penelitian, ---------: area analisis statistik