DIAGNOSTIK MIKROBIOLOGI MOLEKULER Sunaryati Sudigdoadi Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran 2015
KATA PENGANTAR Puji dan syukur dipanjatkan kehadirat Allah Subhanahuwa ta ala atas segala rahmat dan hidayahnya, penulis dapat menyelesaikan menyusun buku ini. Buku ini merupakan tugas khusus sebagai salah satu pemenuhan mata kuliah pada Program Pendidikan Doktor, Program Pascasarjana Universitas Padjadjaran Bandung. Salah satu bidang ilmu terkait dengan Mikrobiologi saat ini yang berkembang secara pesat adalah tentang Biologi Molekuler sehingga berbagai teori molekuler dan berbagai metode molekuler dalam bidang Mikrobiologi banyak dikembangkan. Untuk itu disusunlah buku Diagnostik Mikrobiologi Molekuler ini yang mencakup teori-teori dasar Mikrobiologi Molekuler serta berbagai perkembangan metode diagnostik secara molekuler untuk dapat menentukan mikroba terkait dengan etiologi infeksi. Dengan kerendahan hati penulis sampaikan bahwa penyusunan buku ini terlaksana, sumbangan pikiran, saran, dorongan, dan bantuan lain dari berbagai pihak, serta secara khusus dorongan dari suami Prof. Dr. Sudigdoadi, dr., SpKK(K). Tak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih tak terhingga kepada Prof. Dr. H. Imam Supardi, dr., Sp.MK. (alm) selaku Promotor pada Program Doktor saat itu yang banyak memberikan dorongan kepada penulis. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih yang tak terhingga saran-saran yang sangat berharga tersebut. Akhirul kata penulis mengharapkan buku ini dapat bermanfaat untuk pembaca dikalangan peserta didik mulai dari jenjang pendidikan Strata 1, Strata 2 ataupun peserta pendidikan program Doktor. i
DAFTAR ISI KATA PENGANTAR i DAFTAR ISI iii I. PENDAHULUAN 1 II. MAKROMOLEKUL DAN GENETIKA MIKROBA 4 2.1. Struktur Kimia Asam Nukleat 4 2.2. Struktur Kimia Protein 6 2.3. Struktur DNA 9 2.3.1. Struktur Primer Polinukleotida DNA 9 2.3.2. Struktur Sekunder Polinukleotida DNA 11 2.3.3. Denaturasi dan Renaturasi 14 2.4.Struktur dan Fungsi RNA 19 2.4.1. mrna (messenger RNA) 22 2.4.2. trna (transfer RNA) 23 2.4.3. rrna (ribosomal RNA) 26 2.5. Sintesis dan Replikasi DNA 26 2.5.1. Replikasi bersifat semikonservatif 27 2.5.2. Templat dan Primer 31 2.5.3. Inisiasi dari sintesis DNA 32 2.5.4. Leading/Lagging strands 35 2.5.5. Proofreading 38 2.6. Transkripsi 39 2.6.1. Enzim RNA Polimerase 41 2.6.2. Faktor Sigma 42 2.6.3. Sintesis RNA sel prokariot 47 ii
III. REKAYASA GENETIK DAN BIOKTEKNOLOGI 54 3.1. Sistem Kloning Gen 55 3.2. DNA Sintetik 57 IV. PRINSIP- PRINSIP DIAGNOSTIK MIKROBIOLOGI MOLEKULER 59 4.1. Pelacak (probe) asam nukleat untuk deteksi dan identifikasi penyebab infeksi 59 4.1.1. Bentuk-bentuk Hibridisasi 63 4.1.1.1. Hibridisasi Fase Cairan 63 4.1.1.2. Hibridisasi Fase Padat 65 4.1.2. Indikasi Penggunaan Pelacak di Laboratorium 67 4.1.2.1. Pelacak untuk Enterik Patogen 68 4.1.2.2. Penyakit-penyakit yang ditularkan melalui makanan 71 4.1.2.3. Patogen-patogen pada Saluran Pernafasan 71 4.1.2.4. Patogen-patogen yang ditularkan melalui kontak seksual 74 4.1.2.5. Patogen-patogen lain pada Traktus Urogenital 79 4.1.2.6. Diagnosis Sepsis Bakterial 80 4.1.2.7. Pelacak-pelacak untuk Patogen lain yang ditularkan melalui Darah 82 4.1.2.8. Penyaring Darah dan Produk Darah sebelum Transfusi 83 4.1.2.9. Pelacak-pelacak untuk Gen-gen Resistensi Antimikroba 83 4.1.3. Hibridisasi in situ 86 4.1.3.1. Persiapan Jaringan untuk Hibridisasi 86 4.1.3.2. Sistem-sistem Deteksi 89 4.1.3.3. Interpretasi 93 4.1.3.4. Otomatisasi 93 4.1.3.5. Aplikasi 94 4.1.3.6. Pemakaian pada Masa yang akan datang 96 4.2. Teknik-teknik amplifikasi asam nukleat in vitro 97 4.2.1. Pengaturan Tahap untuk Teknik Amplifikasi 100 4.2.2. Sensitivitas Klinik dan Sensitivitas Analitik 101 4.2.3. Metode-metode Amplifikasi Target 104 4.2.4. Polymerase Chain Reaction 104 iii
4.2.5. Modifikasi PCR 111 4.2.5.1. Multiplex PCR 111 4.2.5.2. Point Mutation Detection 112 4.2.5.3. Nested Amplification 114 4.2.5.4. Deteksi target-target RNA 119 4.2.5.5. PCR Kuantitatif 121 4.2.6. Sistem Amplifikasi Berdasarkan Transkripsi : TAS dan 3SR 121 4.2.7. Strand Displacement Amplification (SDA) 128 4.2.8. Aplikasi Khusus dari Amplifikasi Target 133 4.3. Amplifikasi Molekul Pelacak 135 4.3.1. Amplifikasi Q Replikase dari Molekul Pelacak RNA 136 4.3.2. Amplifikasi yang tergantung DNA Ligase 140 4.3.3. Teknik amplifikasi signal 144 4.3.4. Masalah-masalah penting pada sistem Amplifikasi 145 DAFTAR PUSTAKA 147 RIWAYAT HIDUP 149 iv
DIAGNOSTIK MIKROBIOLOGI MOLEKULER I. PENDAHULUAN Sepanjang perkembangan ilmu pengetahuan para ilmuan selalu berusaha untuk mengatasi kesulitan-kesulitan atau masalah-masalah yang telah dihadapi oleh ilmuan sebelumnya. Sejak ditetapkannya postulat Koch maka berarti bahwa suatu agent penyebab suatu penyakit infeksi harus dapat diisolasi pada suatu biakan murni, harus dapat diidentifikasi, menimbulkan suatu penyakit yang sama pada hewan percobaan, dan dapat diisolasi kembali pada suatu biakan murni. Selanjutnya perkembangan didalam menentukan penyebab penyakit infeksi diawali dengan mengambil bahan pemeriksaan klinik melalui prosedur-prosedur pewarnaan, isolasi dengan menggunakan medium pembenihan, melakukan reaksi-reaksi biokimiawi untuk menentukan produk-produk metabolisme, dan tes-tes serologik atau imunodiagnostik untuk mendeteksi antigen mikroba atau antibodi terhadap antigen mikroba. Pemeriksaanpemeriksaan tersebut dilakukan di bidang Mikrobiologi Kedokteran untuk tujuan diagnostik labolatorik atau tujuan-tujuan penelitian. Dengan menggunakan dogma biakan murni dapat diisolasi dan diidentifikasi penyebab suatu penyakit infeksi yaitu bakteri, jamur atau virus. Namun dengan teknik-teknik yang telah ada, diketahui bahwa beberapa organisme sangat sulit atau mungkin tidak mungkin dibiakan, sehingga harus dicari metode lain untuk dapat menetukan penyebab infeksi tersebut. Selain itu pada beberapa keadaan metode-metode untuk identifikasi sangat terbatas dalam hal sensitivitas atau spesifitas atau keduanya. Untuk menambah sensitivitas, mempercepat waktu pemeriksaan dan menentukan mikroorganisme yang sukar dibiak telah dikembangkan suatu immunoassay yang biasa dilakukan oleh laboratorium-laboratorium yang besar maupun yang kecil untuk mendapatkan hasil diagnosis yang cepat. Kemajuan di bidang biologi molekuler dan bidang pengembangan dari bioteknologi saat ini merupakan langkah baru untuk menetukan penyebab infeksi sehingga dapat digunakan sebagai alat bantu pembantu diagnosis, karena metode-metode biologi molekuler lebih sensitif, lebih spesifik, dan lebih cepat. Prinsip-prinsip dasar di bidang biologi molekuler seperti genetika molekul, faga bakteri, dan enzim-enzim bakteri melahirkan bioteknologi modern pada akhir tahun 1970. Analisis asam nukleat mendapat perhatian dalam beberapa tahun terakhir ini dan saat ini telah banyak dilakukan sebagai dasar yang rutin di dalam pemeriksaan laboratorium klinik. Keuntungan dari pelacak asam-asam nukleat adalah untuk identifikasi organisme 1