BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Manajemen Sumberdaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Jatinangor Jawa Barat, penelitian ini dimulai pada bulan Mei 2013 hingga Juli 2013. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: 1. Peralatan yang digunakan selama pemeliharan dan pengamatan: a. Akuarium berukuran (40x25x25) cm³ sebanyak 20 buah, digunakan untuk pemeliharaan dan pengamatan ikan b. Perlengkapan aerasi (selang dan batu aerasi), digunakan untuk mengaerasi air dalam akuarium agar kaya akan kandungan oksigen c. Heater sebanyak 20 buah untuk menjaga suhu air dalam akuarium d. Saringan ikan untuk mengambil ikan 2. Peralatan yang digunakan pada pembuatan pakan: a. Ember sebanyak 4 buah untuk menampung air dan menampung pelet komersil yang akan ditambahkan vitamin b. Alat pembuat pelet untuk mencetak kembali pelet yang sudah dicampurkan vitamin c. Karung sebanyak 3 buah sebagai tempat pelet pada saat pengeringan 3. Peralatan yang digunakan dalam pengambilan bakteri: a. Jarum ose untuk pengambilan bakteri b. Bunsen untuk menciptakan keadaan aseptik pada saat pengambilan bakteri c. Tabung Falcon untuk menampung bakteri pada larutan NaCl d. Vortex mixer untuk mencampurkan bakteri pada NaCl fisiologis
e. Cuvet sebanyak 2 buah untuk menampung bakteri yang akan dilihat pada spectrophotometer f. Spectrophotometer untuk melihat tingkat kekeruhan bakteri dalam mengestimasi kepadatan bakteri yang diambil sesuai kebutuhan 4. Peralatan yang digunakan untuk penginfeksian bakteri: a. Jarum suntik, digunakan untuk menyuntikan bakteri pada ikan uji 5. Peralatan yang digunakan untuk pengambilan sel darah putih: a. Haemacytometer Neubauer Improved, yang terdiri dari pipet Thomma cover glass dan counting chamber Neubauer Improved digunakan untuk mengambil dan menghitung sel darah putih b. Pisau bedah, digunakan untuk melukai ikan uji c. Mikroskop, digunakan untuk melihat dan mengamati sel darah putih d. Hand counter, digunakan sebagai alat bantu menghitung sel darah putih 3.2.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: 1. Ikan uji yang digunakan merupakan benih ikan lele dumbo berukuran 3-5 cm sebanyak 500 ekor yang berasal dari Balai Benih Ikan Ciparay 2. Pakan yang digunakan merupakan pakan komersil berupa pelet PF 1000 sebanyak 5 kg 3. Vitamin A (retinol) sebanyak 200 mg dalam bentuk serbuk 4. Vitamin C (asam askorbat) sebanyak 200 mg dalam bentuk serbuk 5. Vitamin E (tokoferol) sebanyak 200 mg dalam bentuk minyak 6. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas fluorescens (jenis bakteri penyebab penyakit Pseudomoniasis) sebanyak satu tabung kultur agar miring yang didapat dari Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung 7. NaCl fisiologis sebanyak 500 ml untuk suspensi bakteri 8. Larutan Turk sebanyak 200 ml untuk mengencerkan sel darah putih
3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental menggunakan model RAL (Rancangan Acak Lengkap) dengan 4 perlakuan dan 4 ulangan, yakni: Perlakuan A : Pemberian vitamin A dengan dosis 50 mg/kg pakan Perlakuan B : Pemberian vitamin C dengan dosis 50 mg/kg pakan Perlakuan C : Pemberian vitamin E dengan dosis 50 mg/kg pakan Perlakuan D : Pemberian kombinasi vitamin A, C dan E dengan dosis 50 mg/kg pakan (dosis masing-masing vitamin sebanyak 16.7 mg) Model umum rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut : Y =μ+τ +ε Keterangan : Y : Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ : Nilai rata-rata umum τ : Pengaruh perlakuan ke-i ε : Pengaruh faktor random perlakuan ke-i dan ulangan ke-j 3.4 Prosedur Penelitian Penelitian ini meliputi pembuatan pakan, pengambilan bakteri, penghitungan sel darah putih, serta pemeliharaan, penginfeksian dan pengamatan, yang dijelaskan sebagai berikut: 1. Pembuatan Pakan Pembuatan pakan (Lampiran 1) dilakukan sebelum penelitian dimulai yang dijelaskan sebagai berikut: Pakan komersil berupa pelet sebanyak 4 kg yang dibagi masing-masing 1 kg lalu dibasahi dengan air agar sedikit lunak Dimasukkan vitamin A, C, E dan kombinasi vitamin (vitamin A, C dan E) ke dalam masing-masing pelet sesuai perlakuan lalu diaduk kemudian didiamkan selama 15 menit agar vitamin meresap
Masing-masing pelet pada setiap perlakuan dicetak pada mesin pencetak pelet lalu disimpan di atas karung dan dikeringkan dibawah sinar matahari hingga benar-benar kering Pelet yang sudah kering lalu disimpan dalam suhu ruang agar pelet tahan lama Pelet siap digunakan dalam penelitian 2. Persiapan Akuarium Akuarium dicuci bersih lalu dikeringkan kemudian diisi air sebanyak 20 liter dan ditambahkan garam ikan sebanyak 10 g dan dibiarkan selama satu hari Ikan uji dimasukkan ke dalam akuarium masing-masing sebanyak 20 ekor kemudian diaklimatisasi selama tiga minggu, selama aklimatisasi diberi pakan komersil sebanyak 3% dari bobot tubuh dengan frekwensi tiga kali sehari, yaitu pada jam 08.00, 12.00 dan 16.00 WIB. Pada akhir minggu ke tiga, empat ekor ikan uji diambil darahnya, lalu dihitung sel darah putihnya 3. Pengambilan Sel Darah Putih Pengambilan sel darah putih (Lampiran 3) pada penelitian ini dilakukan tiga kali yang prosedurnya dijelaskan sebagai berikut: Siapkan mikroskop dengan pembesaran 40 kali, lalu letakkan counting chamber Neubauer improved dibawah mikroskop dan diamati hingga terlihat kotak-kotak kecil sebagai tempat perhitungan sel darah putih terlihat Ikan uji diambil dari akuarium lalu dilukai pangkal ekornya dengan pisau bedah Darah yang keluar dihisap dengan menggunakan pipet Thomma sebatas skala 0,5 lalu dihentikan hisapannya dengan menekan ujung lidah ke ujung karet penghisap Tambahkan larutan Turk sampai skala 11
Lepaskan karet penghisap dari pipet dan kedua ujung pipet ditekan dengan ibu jari agar cairan tidak keluar, selajutnya digerakkan dengan arah memutar selama 3 menit agar merata Tetesi kamar hitung dengan cairan darah melalui parit haemacytometer, diamkan beberapa saat kemudian ditutupi dengan cover glass Dilakukan perhitungan sel darah putih dibawah mikroskop dengan bantuan hand counter 4. Perhitungan Bakteri Perhitungan bakteri (Lampiran 2) dilakukan pada saat ikan uji akan diinfeksi yang dijelaskan sebagai berikut: Tabung kultur bakteri agar miring didekatkan dengan api pada bunsen agar pada saat pengambilan bakteri terjadi secara aseptik (menghindari kontaminan/bakteri lain masuk) Bakteri dalam tabung agar miring dengan menggunakan jarum ose yang terlebih dahulu disterilkan dengan dibakar pada bunsen. Bakteri diambil dengan jarum ose yang digoreskan pada permukaan agar miring dalam tabung lalu dimasukkan kedalam tabung Falcon yang telah berisi NaCl fisiologis sebanyak 3 ml Bakteri dalam tabung Falcon dikocok menggunakan vortex mixer hingga larut, ditandai dengan larutan yang menjadi keruh Larutan dimasukkan ke dalam cuvet, kemudian dimasukkan kedalam spectrophotometer untuk dilihat kekeruhanya sebagai estimasi kepadatan bakteri dalam larutan sebanyak 10 Bakteri siap diinfeksikan pada ikan uji 5. Pemeliharaan, Penginfeksian dan Pengamatan Ikan Uji Pada minggu keempat penelitian, ikan uji dipelihara selama satu minggu dalam akuarium dengan tata letak perlakuan yang dilakukan secara acak (Lampiran 4) dengan diberi pakan komersil yang telah dicampur dengan vitamin secara ad libitum dengan frekwensi tiga kali sehari, yaitu pada jam 08.00, 12.00 dan 16.00 WIB.
Pada akhir minggu keempat, empat ekor ikan uji pada masing-masing perlakuan dilakukan perhitungan jumlah sel darah putih dengan diambil darahnya Pada minggu kelima dilakukan kohabitasi dengan menyuntikan bakteri Pseudomonas fluorescens pada ikan uji dan juga menebarkan bakteri dalam air pada masing-masing akuarium sebanyak 0.1 ml (2 x10 cfu) dan dipelihara selama dua minggu lalu diamati gejala klinis yang timbul Pada akhir minggu keenam, empat ekor ikan uji pada masing-masing perlakuan dilakukan perhitungan jumlah sel darah putih dengan diambil darahnya Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setelah penginfeksian bakteri hingga akhir penelitian Pengukuran kualitas air sebagai data penunjang dilakukan tiga kali (Lampiran 5) yaitu pada minggu ketiga (awal), minggu keempat (pemberian pakan bervitamin), dan minggu keenam (setelah penginfeksian) 3.5 Parameter yang Diamati Parameter yang diamati adalah sebagai berikut: 1. Jumlah Sel Darah Putih Perhitungan sel darah putih menggunakan rumus Schaperclaus (1992) sebagai berikut: N = n x 500 Keterangan: N : Jumlah sel darah putih dalam 1 ml darah n : Jumlah sel darah putih yang terdapat pada 4 kotak besar yang terletak pada sudut counting chamber
2. Tingkat Kelangsungan Hidup Tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo dihitung menurut Effendi (2002), yaitu: Keterangan: SR = x 100% SR : Kelangsungan hidup ikan (%) Nt No : Jumlah ikan yang hidup pada akhir percobaan : Jumlah ikan pada awal percobaan 3. Gejala Klinis Pengamatan gejala klinis dilakukan dengan melihat kerusakan yang timbul pada permukaan kulit tubuh ikan. 3.6 Analisis Data Hasil perhitungan sel darah putih dan tingkat kelangsungan hidup diuji dengan menggunakan uji Duncan pada taraf 5% (Gasperz 1991), sedangkan gejala klinis dianalisis secara deskriptif.