11 MATERI DAN METODA Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini berlangsung dari bulan Juni 2010 sampai dengan Juni 2011. Penelitian dilakukan di kandang FKH-IPB. Pengujian sampel dilakukan di Laboratorium Terpadu bagian Mikrobiologi FKH-IPB. Bahan dan Alat Penelitian Hewan Percobaan Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ayam jantan petelur jenis white leghorn, umur satu hari (DOC). Ayam yang digunakan berasal dari induk yang sudah diberikan vaksinasi AI sebelumnya. Jumlah ayam yang diamati sebanyak 100 ekor. Ayam tersebut dibagi dalam dua kelompok yaitu A1V (diberikan vaksin AI) dan A1K (tidak diberikan vaksin AI atau sebagai kontrol). Kelompok kontrol digunakan untuk sebagai parameter bahwa disekitar kandang percobaan benar-benar bebas dari virus avian influenza.kelompok kontrol juga digunakan untuk membandingkan hasil titer antibodi yang terjadi dengan kelompok yang diberi perlakuan vaksinasi. Masing-masing kelompok terdiri dari 50 ekor ayam. Vaksin AI Vaksin AI yang digunakan dalam penelitian ini adalah vaksin AI H5N1 inaktif (killed vaccine) isolat tahun 2007 strain Subang (A/chiken/West Java- Subang/29/2007) yang berasal dari perusahaan vaksin komersial di Indonesia. Pakan Pakan yang digunakan pada pemeliharaan ayam penelitian ini adalah pakan konsentrat komersial yang diberikan setiap pagi harinya. Air minum diberikan ad libitum. Kandang dan Perlengkapannya Pada penelitian ini digunakan dua kandang litter sebesar 2x3 meter yang
12 terbuat dari tembok yang dibatasi oleh kawat ram dan dilengkapi tempat minum dan tempat makan terbuat dari plastik yang dibersihkan setiap hari. Kandang juga dilengkapi dengan lampu listrik. Bahan dan Peralatan Perlengkapan Uji Laboratorium Bahan yang digunakan adalah virus AI standar dengan titer 4 HAU, suspensi RBC 1%, serum kebal AI, es batu, NaCl fisiologis 0.85%, larutan Phospate Buffer Saline (PBS) ph 7.2. Alat yang digunakan yaitu spuit 1 ml, spuit 3 ml, inkubator, lemari es, mikroplate V bottom, mikropipet 100 l, kertas label, kapas, alat sentrifugasi, tabung reaksi, marker (spidol), gelas piala, termos es, cawan petri, tabung mikro. Metode Penelitian Rancangan Percobaan Percobaan dilakukan dengan rancangan penelitian seperti pada Tabel 2. Tabel 2 Rancangan penelitian pada masing-masing kelompok Umur ayam Perlakuan pada masing-masing kelompok (minggu) A1V A1K Awal penelitian Pengambilan sampel darah Pengambilan sampel darah (sehari) 2 -Pengambilan sampel darah -Vaksinasi kesatu Pengambilan sampel darah 4 Pengambilan sampel darah Pengambilan sampel darah 6 -Pengambilan sampel darah -Vaksinasi kedua Pengambilan sampel darah 8 Pengambilan sampel darah Pengambilan sampel darah 10 Pengambilan sampel darah Pengambilan sampel darah Pada penelitian ini dilakukan vaksinasi dengan vaksin AI H5N1 inaktif isolat tahun 2007. Rute vaksinasi subkutan dan dosis yang diberikan sebanyak 0.2 ml/ekor (sesuai aturan produsen vaksin). Vaksinasi dilakukan sebanyak dua kali pada saat ayam berumur dua minggu dan enam minggu. Sampel yang diambil adalah sebanyak sepuluh ekor pada masing-masing kelompok ayam yang di vaksin (A1V) maupun tidak di vaksin (A1K). Sampel darah diambil pada saat dua minggu sebelum dan setelah vaksinasi sesuai jadwal yang direncanakan. Hal ini
13 bertujuan untuk melihat titer antibodi yang terbentuk serta menentukan kapan waktu dilakukannya booster. Serum yang diambil diukur titer antibodinya terhadap virus AI dengan uji HI menggunakan antigen standar AI H5N1 produksi Pusvetma. Pemeliharaan Hewan Coba Populasi ayam pejantan yang diamati secara keseluruhan yaitu 100 ekor. Ayam ini dibagi dalam dua kelompok. Kelompok ayam ini dipelihara di kandang yang terletak di kandang uji coba. Ayam diberi pakan dengan standar komersial dan diberi minum ad libitum. Pengambilan Darah dan Evaluasi Titer Antibodi Pengambilan darah sampel dilakukan dengan metode penarikan contoh acak (random sampling) sebanyak 10 ekor pada masing-masing kelompok ayam. Ayam diambil darahnya menggunakan spuit 3 ml di daerah sayap yaitu pada vena brachialis secara legeartis (sesuai dengan cara yang tepat). Darah tersebut selanjutnya dibawa ke Laboratorium Terpadu bagian Mikrobiologi FKH-IPB. Darah dibiarkan tetap berada di dalam spuit dan disimpan dalam lemari es selama satu malam. Selanjutnya serum yang terpisah dari darah diambil dan dilakukan evaluasi titer antibodi dengan uji hambat aglutinasi atau haemagglutination inhbition (HI) test. Pembuatan suspensi sel darah/rbc (Red Blood Cell) Darah utuh (whoole blood) yang diperoleh dari ayam dewasa sehat kemudian dicampur dengan antikoagulan Na Sitrat dengan perbandingan 4:1, darah dipisahkan dari Na Sitrat dengan cara disentrifugasi 2000 rpm (Heareus ) selama 10 menit. Hasil sentrifugasi dibuang supernatannya dan diambil endapannya. Endapan tersebut merupakan sel darah merah. Selanjutnya endapan dicuci dengan menambahkan NaCl fisiologis kemudian disentrifugasi pada kecepatan dan waktu yang sama (2000 rpm (Heareus ) selama 10 menit). Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, hasil pencucian sel darah merah yang diperoleh merupakan suspensi sel darah merah dengan konsentrasi 100%.
14 Suspensi sel darah tersebut kemudian diencerkan menjadi suspensi 50% dan diukur konsentrasinya menggunakan kapiler hematokrit untuk menentukan konsentrasinya. Selanjutnya berdasarkan konsentrasi suspensi sel darah merah yang diperoleh, dilakukan pengenceran suspensi sel darah merah menjadi 5%. Suspensi sel darah merah 5% tersebut sebagai larutan stok dan disimpan di suhu 4 C. Saat akan digunakan uji haemaglutinasi mikrotitrasi suspensi sel darah merah stok diencerkan menjadi 1%. Semua pengenceran suspensi sel darah merah menggunakan larutan PBS. Uji HA mikrotitrasi Uji HA ini digunakan untuk membuat virus AI standar (4 HAU). Antigen yang digunakan dalam penelitian ini merupakan isolat virus AI standar subtipe H5N1 produksi Pusvetma Surabaya. Adapun prosedur uji HA mikrotitrasi yaitu : 1. Sebanyak 25 l PBS dimasukkan ke dalam sumur microplate berbentuk V (V bottom microplate). 2. Sebanyak 25 l suspensi virus dimasukkan pada lubang pertama dan dilakukan pengenceran menggunakan micropipette dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak lima kali lalu memindahkan 25 l campuran ke sumur kedua. Pengenceran dilakukan hingga sumur ke-12. Pada sumur ke-12, campuran sebanyak 25 l dibuang. 3. Sebanyak 25 l PBS dimasukkan lagi ke dalam sumur yang telah berisi suspensi virus. 4. Sebanyak 25 l RBC 1% dimasukkan ke dalam semua sumur. 5. Microplate digoyang (untuk menghomogenkan) kemudian diinkubasikan pada suhu 4 C selama 60 menit. 6. Hasil diamati setelah sumur kontrol positif tampak mengendap. Pembacaan dilakukan dengan cara sebagai berikut : pada lubang yang menampakkan terjadinya endapan seperti pada lubang kontrol negatif dinyatakan negatif HA, sedangkan yang menunjukkan terjadinya aglutinasi (penggumpalan RBC) dinyatakan positif HA (OIE 2008).
15 Uji HI mikrotitrasi Titer antibodi ayam terhadap virus AI dilakukan dengan uji Hambat Aglutinasi (HI Test) mikrotitrasi menurut OIE (2008). Prosedur uji HI mikrotitrasi : PBS sebanyak 25 l dimasukkan ke dalam sumur microplate berbentuk V (V bottom microplate). 25 l serum ayam dimasukkan pada lubang pertama dan dilakukan pengenceran menggunakan micropipette dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 5 kali lalu memindahkan 25 l campuran ke sumur kedua. Pengenceran dilakukan hingga sumur ke-12. Pada sumur ke-12, campuran sebanyak 25 l dibuang. Suspensi virus AI standar (4 HAU) sebanyak 25 l dimasukkan kedalam sumur berisi serum yang telah diencerkan lalu di homogenkan dan inkubasi pada suhu 4 C selama 60 menit. Plate pengujian yang telah diinkubasi kemudian ditambah dengan RBC 1% sebanyak 25 l ke semua sumur. Plate digoyang selama 10 detik untuk menghomogenkan larutan dan inkubasi pada suhu 4 C selama 60 menit. Hasil diamati seteleh sumur kontrol positif tampak adanya reaksi penghambatan aglutinasi. Titer antibodi dihitung dengan melihat batas akhir penghambatan aglutinasi sempurna. Batas akhir pada pengenceran tertinggi yang mampu menghambat terjadinya aglutinasi secara sempurna dan disebut dengan end point. Antibodi terhadap AI dinyatakan protektif bila titer yang terbentuk adalah 2 4 (Deptan 2006). Rataan titer antibodi dihitung dengan menggunakan Geometric Mean Titre (GMT) dengan rumus : Log2 GMT = ( Log2 t1 )( S1 ) + ( Log2 t1 )( S1 ) + + ( Log2 tn )( Sn ) N
16 Keterangan : N t S N = Jumlah contoh serum yang diamati = Titer antibodi pada pengenceran tertinggi (yang masih dapat menghambat aglutinasi sel darah merah) = Jumlah contoh serum yang bertiter t = Titer antibodi pada sampel ke-n