III. METODE PENELITIAN A. Materi Alat dan Bahan Materi yang digunakan dalam penelitian yaitu sampel daun jambu semarang Buah Pink, Hijau Bulat, Unsoed, Merah Lebar', Kaget Merah, Camplong Putih, Irung Petruk dan Lilin Merah. Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat preparat dalam penelitian ini terlampir pada lampiran 2. Alat-alat yang digunakan untuk membuat preparat dalam penelitian ini terlampir pada lampiran 2. B. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni-Juli 2014. C. Rancangan Percoban Metode yang digunakan dalam penelitian adalah metode survai dengan teknik pengambilan sampel secara acak terpilih (purposive random sampling). D. Variabel dan Parameter Variabel yang diamati pada penelitian ini adalah karakter anatomi daun beberapa jambu semarang (Syzygium samarangense). Parameter penelitian meliputi tebal epidermis (atas dan bawah), tebal palisade, ukuran palisade (panjang dan lebar), tebal kutikula, jumlah stomata per satuan luas daun, ukuran stomata (panjang dan lebar), tipe, dan letak sel stomata. E. Cara Kerja Penelitian E. 1. Pengambilan Sampel Daun Sampel daun jambu semarang dipilih, diambil daun kedua dari pucuk pada pekarangan yang memiliki tumbuhan jambu semarang dari beberapa lokasi di Purwokerto dan sekitarnya. Identifikasi kultivar jambu semarang menggunakan referensi Widodo (2011), dengan judul validasi status taksonomi Syzygium samarangense dan S. aqueum berdasarkan karakter morfologi dan molekuler.
E. 2. Pembuatan Preparat Segar Daun Sampel daun jambu yang akan diteliti karakteristik stomatanya dibuat preparat segar menurut Rompas et al., (2011) sebagai berikut: a. Setiap sampel daun penelitian diolesi dengan kutek selama + 3 menit. b. Setelah daun yang diolesi kutek mengering, kutek diambil menggunakan pinset. c. Kutek yang diambil dari sampel daun selanjutnya dilekatkan di gelas benda, ditetesi air dan ditutup dengan gelas penutup. d. Preparat segar kemudian diamati di bawah mikroskop binokuler. E. 3. Pembuatan Preparat Anatomi Daun Pembuatan preparat awetan daun dengan metode paraffin, pewarnaan dengan safranin 1% menurut Sass (1958) adalah sebagai berikut: a. Daun dipotong ± 1 cm menggunakan silet yang tajam. b. Potongan daun tersebut kemudian dimasukkan kedalam botol flakon yang berisi larutan fiksatif FAA selama 24 jam. Komposisi larutan fiksatif FAA: Alkohol 70% 90 ml, asam asetat glacial 5 ml dan formalin 5 ml. c. Dehidrasi : larutan FAA diganti secara bertingkat dengan: Alkohol 70% selama 30 menit, alkohol 80% selama 30 menit, alkohol 90% selama 30 menit dan ethanol selama 30 menit d. Dealkoholisasi: Alkohol diganti dengan: Ethanol/xylol (3:1) selama 30 menit, ethanol/xylol (1:1) selama 30 menit, ethanol/xylol (1:3) selama 30 menit, xylol I selama 30 menit, dan xylol II selama 30 menit. e. Infiltrasi: Potongan daun dimasukkan ke dalam campuran xylol/parafin 1: 9 selama 24 jam di dalam oven dengan temperatur 57ºC. Setelah 24 jam, campuran xylol/parafin 1:9 diganti dengan parafin murni selama 2 jam di dalam oven dengan temperatur 57ºC. f. Pembuatan Blok: Potongan daun dimasukkan ke dalam kotak karton yang berisi parafin cair dengan posisi di tengah sehingga tepat terselubungi oleh parafin dan dibiarkan membeku. 8
g. Penempatan Blok: Parafin dilepaskan dari kotak karton, diiris dengan hati-hati, lalu ditempel pada kayu (holder) menurut arah sayatan, dilakukan dengan mencairkan sebagian blok parafin dengan skalpel yang telah dipanasi kemudian diletakkan pada kayu (holder). h. Pengirisan: Pengirisan organ dalam blok parafin menggunakan mikrotom putar, dengan tebal irisan ±10 µm. i. Penempatan Pita Parafin: Pita-pita parafin diletakkan di atas gelas benda yang telah diolesi dengan campuran gliserin/albumin 1:1, lalu ditetesi air. Selanjutnya gelas benda diletakkan di atas pemanas (hot plate) sampai kering. j. Pewarnaan: Gelas benda dari irisan sampel daun direndam kedalam staining jar dengan urutan dan lama waktu sebagai berikut: Larutan xylol I selama 3 menit, larutan xylol II selama 3 menit, xylol/ethanol (3:1) selama 3 menit, xylol/ethanol (1:1) selama 3 menit, xylol/ethanol (1:3) selama 3 menit, ethanol selama 3 menit, alkohol 90% selama 3 menit, alkohol 80% selama 3 menit, alkohol 70% selama 3 menit, safranin 1% dalam alkohol 70% selama 1-2 jam, alkohol 70% selama 3 menit, alkohol 80% selama 3 menit, alkohol 90% selama 3 menit, ethanol 3 menit, ethanol/xylol (3:1) selama 3 menit, ethanol/xylol (1:1) selama 3 menit, ethanol/xylol (1:3) selama 3 menit, xylol I selama 3 menit, dan xylol II selama 3 menit. k. Mounting: Preparat ditetesi entellan lalu ditutup dengan gelas penutup dan dikeringkan di atas hotplate. l. Preparat diamati dibawah mikroskop. E. 4. Mencari Nilai Skala Mikrometer Okuler Mencari nilai skala mikrometer okuler menurut Sass (1958) adalah sebagai berikut: a. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, diatur hingga terlihat bayangan skala mikrometer okuler dengan jelas. b. Mikrometer objektif dipasang pada meja objektif mikroskop, diatur hingga terlihat bayangan skala mikrometer objektif dengan jelas. 9
c. Bayangan skala mikrometer okuler dan objektif kemudian dihimpitkan. d. Jumlah skala mikrometer okuler dan objektif yang berhimpit tersebut kemudian dihitung 3-5 kali ulangan. e. Jarak sesungguhnya antara kedua garis skala mikrometer dikalibrasi dengan rumus: X Sob = Y Sok = = x = x 10 Keterangan: Sob = Skala mikrometer objektif Sok = Skala mikrometer okuler E. 5. Menghitung Jumlah Stomata Menghitung jumlah stomata menurut Lestari (2006) adalah sebagai berikut: a. Mikrometer square dipasang pada lensa objektif mikroskop. b. Preparat segar daun jambu diletakkan diatas meja preparat mikroskop kemudian dicari fokusnya. c. Stomata dihitung pada perbesaran 100x. d. Perhitungan dilakukan dengan 10 bidang lapang pandang yang berbeda. e. Rumus perhitungan stomata: Jumlah stomata Kerapatan stomata= Satuan luas bidang pandang (mm²) E. 6. Mengukur Ukuran Stomata (Panjang dan Lebar) dan Palisade Mengukur ukuran panjang dan lebar stomata dan palisade menurut Sulistyaningsih et al., (1994) adalah sebagai berikut: a. Preparat sampel diletakkan pada meja preparat mikroskop kemudian dicari fokus bayangan preparat. b. Letak mikrometer okuler diatur sesuai dengan panjang dan lebar sel kemudian diukur pada perbesaran 400x. c. Pengukuran panjang dan lebar sel dilakukan hingga 10x ulangan. 10
E. 7. Mengukur Epidermis, Palisade dan Kutikula Mengukur tebal epidermis, lebar epidermis, lebar palisade, panjang palisade, dan tebal kutikula menurut Sulistyaningsih et al., (1994) adalah sebagai berikut: a. Preparat sampel diletakkan pada meja preparat mikroskop kemudian dicari fokus bayangan preparat. b. Pengukuran dilakukan pada perbesaran 400x menggunakan mikrometer okuler. c. Pengukuran dilakukan hingga 10x ulangan. E. 8. Analisis Hubungan Kemiripan Syzygium samarangense Untuk mengetahui hubungan kemiripan data dianalisis menggunakan software MEGA 5,0. Cara analisis data adalah sebagai berikut: a. Menetapkan sifat dari semua karakter yang ada dengan angka 0, 1, 2, dan 3. b. Dimasukkan dalam tabel di Microsoft excel. c. Dicopy & paste ke Microsoft word kemudian di-merge. d. Direplace 0 menjadi A, 1 menjadi T, 2 menjadi G, dan 3 menjadi C. e. Dicopy & paste ke software MEGA. f. Memilih Phylogeny kemudian bootstrap test of Phylogeny. g. Memilih UPGMA dan akan terlihat fenogram yang tebentuk. h. Melihat indeks disimilaritas dengan memilih distance kemudian compute pairwise. F. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif, yaitu menggambarkan dan menginterpretasi struktur anatomi. 11