34 III MATERI DAN METODE PENELITIAN 3.1. Bahan Penelitian 3.1.1. Ternak percobaan Ternak percobaan yang digunakan berupa 48 ekor itik Cihateup berumur 14 minggu dengan rata-rata bobot badan 1049,825 gram ± 48,6097 gram fase grower. Sampel itik tersebut diperoleh dari Pusat Breeding Center Itik Laboratorium Produksi Ternak Unggas dan dipelihara dalam kandang percobaan Laboratorium Produksi Ternak Universitas Padjajaran di daerah Jatinangor, Sumedang Jawa Barat. Itik tersebut diberi 4 perlakuan dan 6 kali pengulangan dengan setiap pengulangan berjumlah 2 ekor itik. 3.1.2. Kandang Percobaan Kerangka kandang terbuat dari kayu sebagai alas serta sisinya menggunakan papan dan kawat ram. Model kandang penelitian ini adalah kandang paggung. Setiap flock berukuran 1 x 0,75 x 0,5 m dengan kapasitas 3 ekor. Masing - masing pen diberi tempat pakan dan tempat minum dengan ukuran 2,5 liter. Sanitasi kandang dilakukan dengan cara memberi kapur pada bagian alas dan dinding kandang satu minggu sebelum itik dimasukan.
35 3.1.3. Ransum yang digunakan Ransum percobaan yang digunakan selama penelitian berbentuk mash. Dengan Protein 15,96 dan EM 3014,3 15,96. Komposisi zat-zat bahan pakan dan energi metabolis disajikan pada Tabel 1, Tabel 1. Kandungan Energi Metabolis dan Zat Nutrien Ransum Percobaan Bahan Pakan EM PK LK SK Ca P Lys Met Sys Kkal /kg...%... Jagung 3370 8,60 3,90 2,00 0,02 0,10 0,20 0,18 0,18 kuning Dedak 1630 12,00 13,00 12,00 0,12 0,20 0,77 0,29 0,40 halus Bungkil 2240 45,00 0,90 6,00 0,22 0,29 2,90 0,65 0,67 kedelai Bungkil 2120 21,00 1,80 15,00 0,20 0,20 0,64 0,29 0,30 kelapa Tepung ikan 3080 60,00 9,00 1,00 5,50 2,80 5,00 1,80 0,94 Tepung tulang 0 0,00 0,00 0,00 24,00 12,00 0,00 0,00 0,00 Minyak kelapa 8600 0,00 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Premix 0 0,00 0,00 0,00 10,00 5,00 0,30 0,00 0,10 Keterangan : EM PK LK SK Ca P Sumber: Data Sekunder dari Laboratorium Produksi Ternak Unggas Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, 2015. = Energi Metabolis = Protein Kasar = Lemak Kasar = Serat Kasar = Calsium = Phospor
36 Tabel 2. Formula Bahan Pakan Ransum Percobaan Bahan Pakan Jumlah (%) Jagung kuning 65,00 Dedak halus 12,00 Bungkil kedelai 8,00 Bungkil kelapa 3,00 Tepung ikan 8,00 Tepung tulang 2,00 Minyak kelapa 1,50 Premix 0,50 Total 100 Sumber : Hasil Perhitungan Tabel 1. Tabel 3. Kandungan Energi Metabolis dan Zat Nutrien Ransum Percobaan EM (Kkal/Kg) PK (%) Ca (%) P (%) Lys (%) Met (%) Nutrien Ransum Penelitian* Kebutuhan Itik Grower** 3014,3 15,96 1,028 0,6 0,87 0,36 Sumber : *) Hasil Perhitungan dari Tabel 1. **) NRC (1984) ***) ARC (1975) 3.2. Alat dan Bahan yang Digunakan 2800 16,00 0,60 0,60 0,90 0,56 *** 3.2.1. Alat yang digunakan a. Syringe b. Vakutainer ber-edta 5 ml c. Stand Vakutainer d. Cooling Box e. Glass Arloji f. Baker Glass
37 g. Pipet Tetes h. Mikroskop i. 1 set Haemocytometer lengkap yang terdiri dari : a. 1 buah pipet yang berisi batu merah (Menghitung jumlah eritrosit) b. 1 buah pipet yang berisi batu putih (Menghitung jumlah leukosit) c. 1 buah kamar hitung dengan penutup (Cover glass). j. Handcounter k. Alat Centrifuge l. Kristoseal m. Micro Capillary Reader n. Mistar o. 1 set Hemometer Sahli-Hellige p. Tissue q. Kertas Label r. Solatip s. Alat Tulis 3.2.2. Pengukuran Kondisi Hematologis : 3.2.2.1. Alat : a. Syringe b. Vakutainer ber-edta 5 ml c. Stand Vakutainer d. Cooling Box e. Glass Arloji
38 f. Baker Glass g. Pipet Tetes h. Mikroskop i. 1 set Haemocytometer lengkap yang terdiri dari : j. 1 buah pipet yang berisi batu merah (Menghitung jumlah eritrosit) k. 1 buah pipet yang berisi batu putih (Menghitung jumlah leukosit) l. 1 buah kamar hitung dengan penutup (Cover glass). m. Handcounter n. Alat Centrifuge o. Kristoseal p. Micro Capillary Reader q. Mistar r. 1 set Hemometer Sahli-Hellige s. Tissue t. Kertas Label u. Solatip v. Alat Tulis 3.2.2.2. Bahan : a. Darah b. Desinfektan (Alkohol 70%) c. Aquadest d. HCl 0,1 N
39 e. Vaccinostyle Steril f. Larutan Hayem dan Turk untuk pengencer darah pada perhitungan eritrosit dan Leukosit terdiri dari : 1. Mercuri Chlorida 0,5 gram 2. Natrium Sulfat 5 gram 3. Natrium Chlorida 1 gram 4. Aquadest 200 ml 3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Persiapan Kandang a. Membersihkan kandang terlebih dahulu dari sisa-sisa kotoran. b. Memberikan larutan kapur (pengapuran) secara merata. c. Mencuci terlebih dahulu tempat pakan dan minum itik menggunakan desinfektan. d. Persiapan kandang dilakukan dengan cara menyekat tiap-tiap flock menggunakan triplek dan kawat. Setiap flock berisi 3-4 ekor itik. e. Memberikan pakan dan minum dengan ukuran 2,5 liter disetiap flock nya. 3.3.2. Pemeliharaan Itik Pemberian pakan & minum dilakukan pagi dan sore hari. Pada pagi hari dilakukan pada pukul 07.00-8.00 dan sore hari dilakukan pada pukul 16.00-17.00. Pada pagi hari dilakukan pencucian tempat minum agar bersih dan juga
35 mengurangi jumlah bakteri akibat kotoran yang ada disekitar tempat minum (Round Waterer). Pada saat sore hari sebelum pemberian pakan dilakukan juga pemberian perlakuan yaitu FOS sekitar pukul 15.00 WIB. Pada saat pemberian pakan, minum, dan juga fos dilakukan pengecekan apabila ada itik yang mati atau terjepit dan segera dilakukan tindakan. Pemeliharaan itik dilaksanakan pada umur 14 minggu sampai dengan 20 minggu. 3.3.3. Fructooligosaccharide (FOS) a. Ekstraksi FOS Tahapan pertama yang dilakukan untuk optimasi proses ekstraksi fruktooligosakarida sesuai dengan modifikasi prosedur (Kaffi S. S. dkk., 2010). Sebanyak 10 kg kulit pisang batu direndam dalam 30 L larutan etanol 70% selama 14 hari. Selama perendaman setiap hari dilakukan pengadukan kurang lebih 10 menit. Selanjutnya filtrat disaring dengan menggunakan kain saring dan diuapkan dengan evaporator vakum hingga menjadi 1 L. Filtrat pekat tersebut kemudian diekstrak dengan etil asetat (EtOAc) sehingga diperoleh fraksi air. Selanjutnya fraksi air tersebut diuapkan hingga kering kemudian dimasukkan dalam Diaion LH-20 kolom kromatografi. Fraksi yang mengandung FOS kemudian dilakukan pemurnian lebih lanjut dengan menggunakan teknik pemurnian seperti kolom kromatografi, Preparative Thin Layer Chromatography (PTLC), atau kristalisasi. Senyawa FOS yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan spektoskopi. b.pengujian kualitatif dengan TCL (Thin Layer Chromatography)
36 Masing-masing fraksi yang diperoleh diuji dengan metode TCL dengan cara meneteskan pada plate. Selanjutnya plate dikembangkan dengan kombinasi pelarut methanol-air untuk mendapatkan spot. Pengujian juga dilakukan dengan membandingkan retention time standar senyawa FOS dengan menggunakan metoda kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). 3.3.4. Pengambilan Sampel Darah a. Sebanyak 30 ekor itik cihateup fase grower dipersiapkan. b. Sampel darah diambil dari itik cihateup fase grower. c. Bagian vena pektoralis eksterna yang terdapat di bawah sayap dibersihkan menggunakan alkohol 70%. d. Bagian vena pektoralis eksterna diambil sebanyak 9 ml. e. Sample darah segera dimasukkan ke dalam vakutainer yang mengandung antikoagulan EDTA untuk mencegah proses pembekuan darah. f. Vakutainer dimasukan ke dalam cooling box pada saat akan dibawa ke laboratorium. 3.3.4.1. Kadar Hemoglobin a. Tabung hemometer diisi dengan HCl 0,1 N sampai garis batas. b. Sampel darah dihisap dengan pipet Hemometer Sahli-Hellige sampai tanda garis 20 mm 3. c. Kemudian darah dimasukkan ke dalam tabung Hemometer Sahli-Hellige yang sudah berisi HCl 0,1 N.
37 d. Dicampurkan/diaduk dengan alat pengaduk yang tersedia (darah akan terlihat berwarna coklat). Hal ini menunjukkan adanya hemolisis. e. Kemudian ditambahkan aquadest tetes demi tetes sampai warna sampel sesuai dengan warna standar Sahli. f. Kemudian tinggi menicus (permukaan) cairan pada tabung Hemometer Sahli dibaca, angka yang terbaca menunjukkan kadar hemoglobin dari sampel darah (satuan Hb = g/dl). 3.3.4.2. Menghitung Jumlah Eritrosit a. Pengambilan darah dengan cara menusuk bagian vena pektoralis eksterna yang terdapat di bawah sayap. b. Menghisap darah dengan pipet haemocytometer yang berbatu merah sampai tanda 1. Diusahakan bekerja dengan cepat jangan sampai darah membeku di dalam pipet. c. Darah dalam pipet diencerkan dengan mengisap larutan hayem sampai tanda 101, dengan demikian darah tersebut telah diencerkan sebanyak 100 kali. d. Mengocok pipet dengan membentuk angka delapan horizontal. Hasil ini untuk mencegah tercampurnya larutan hayem dalam kapiler. e. Larutan darah dalam larutan hayem ini dibiarkan selama 15 menit. f. Membuang beberapa tetes larutan dari dalam pipet.
38 g. Memasukan sampel darah ke dalam kamar hitung kemudian ditutup dengan cover glass. h. Melihat di bawah mikroskop 40 kali, butir-butir eritrosit yang berada di dalam kotak-kotak kecil dihitung. Untuk menghitung jumlah eritrosit, kita harus menghitung sebanyak 40 kotak. 3.3.4.3. Menghitung Jumlah Leukosit a. Menghisap darah dengan menggunakan pipet leukosit sampai tanda 1 b. Mengencerkan darah dengan larutan Turk sampai tanda 11 c. Mengocok campuran darah dengan larutan Truk dengan gerakan angka 8, selama 15 menit d. Membersihkan kamar hitung burker dengan hati-hati dan kaca penutupnya e. Menempatkan kaca penutup diatas kamar hitung burker f. Membuang 3-4 tets pertama g. Meneteskan 5 tetes pada bintik kuning yang telah disiapkan, bila terlalu banyak maka hisap dengan menggunakan kerta hisap agar memudahkan perhitungan sel h. Menghitung dibawah mikroskop dengan perbesarn 10x40 i. Menghitung jumlah leukosit dalam kotak besar, sebanyak 25 kotak a. Perhitungan : b. Volume Kotak Kecil = mm 3
39 c. Volume 25 kotak = 25 mm 3 j. Maka jumlah leukosit Y/mm3 (butir) = Jumlah sel terhitung x 10 x 10 = 100 Y butir. 3.3.4.4. Penentuan Nilai Hematokrit a. Memasukkan ke dalam kapiler hematokrit yang sudah mengandung antikoagulan dengan cara dihisap sampai jarak 1 cm dari ujung bagian atas. b. Menutup salah satu kapiler dengan kristoseal. c. Kemudian kapiler yang sudah berisi darah tersebut dicentrifuge dengan menggunakan alat centrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. d. Setelah dicentrifuge, darah akan terpisah antara sel-sel darah dan plasmanya. e. Kemudian volume sel-sel darah yang sudah terpisah dalam kapiler dibaca dengan menggunakan alat pembaca mikrokapiler (micro capillary reader). 3.4. Peubah yang Diamati Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah : a. Kadar Hemoglobin
40 Darah dengan larutan HCl 0,1 N akan membentuk hematin yang berwarna coklat. Warna disamakan dengan warna standar Sahli dengan menambahkan aquadest sebagai pengencer. Penentuan kadar Hb dilakukan dengan menggunakan metode Hematin asam dengan Hemometer Sahli-Hellige (g/dl). b. Jumlah Eritrosit Jumlah eritrosit dihitung dengan menggunakan 1 set alat yang disebut haemocytometer. Pewarnaan darah dengan suatu pengencer khusus yaitu larutan Hayem yang bersifat isotonis dan berfungsi sebagai pewarna eritrosit. Darah yang telah diencerkan di dalam pipet haemocytometer, kemudian dimasukkan ke dalam kamar hitung dan dihitung di dalam mikroskop. Perhitungan : Kotak kecil mempunyai ukuran lebar 1/20 mm, panjang 1/20 mm, dan tinggi 1/10 mm, maka volume kotak kecil 1/4000 mm3 volume 40 kotak kecil = 40 1/4000 mm3 = 1/100 mm3 Bila didapatkan x butir dalam 40 kotak dengan pengenceran darah 100 kali, maka dapat dihitung jumlah eritrosit dalam 1 mm3 darah Jumlah eritrosit dalam 1mm3 = 100 100 X butir = 10000 X butir c. Jumlah Leukosit Kamar hitung yang sebaiknya dipakai ialah yang memakai garis bagi improved Neubauer. Luas seluruh bidang yang dibagi adalah 9 mm2 dan
41 bidang ini dibagi menjadi Sembilan bidang besar yang luasnya masing-masing 1 mm2. Bidang besar dibagi lagi menjadi 16 bidang sedang yang luasnya masing-masing 1/4 x 1/4 mm2. Bidang besar yang letaknya di tengah-tengah berlainan pembaginya: ia dibagi menjadi 25 bidang dan tiap bidang itu dibagi lagi menjadi 16 bidang kecil. Dengan demikian jumlah bidang kecil itu seluruhnya 400 buah,masing-masing luasnya 1/20 x 1/20 mm2. Tinggi kamar hitung, yaitu jarak antara permukaan yang bergaris-garis dan kaca penutup yang berpasangan adalah 1/10 mm. Maka volume diatas tiap-tiap bidang menjadi sbb; 1 bidang kecil = 1/20 x 1/20 x1/10 =1/4000 mm3 1 bidang sedang = 1/4 x 1/4 x 1/10 =1/160 mm3 1 bidang besar = 1 x 1 x 1/10 = 1/10 mm3 Seluruh bidang yang dibagi = 3 x 3 x 1/10 = 9/10 mm3 d. Nilai Hematokrit Penentuan nilai hematokrit di dalam darah dilakukan dengan metode mikro hematokrit. Darah yang dicampur dengan antikoagulan dicentrifuge dengan menggunakan alat centrifuge sehingga akan membentuk lapisan-lapisan. Lapisan yang terdiri atas butir-butir eritrosit diukur dan dinyatakan sebagai % volume dari keseluruhan darah. Nilai Hematokrit = 100% 3.5. Rancangan Penelitian dan Analisis Statistik
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis sidik ragam Polinomial 42 Orthogonal. Metode Perlakuan yang dicobakan adalah Fructooligosaccharide dengan konsentrasi yang berbeda (P) sebagai berikut: K = Tanpa Pemberian FA = konsentrasi Fructooligosaccharide 50 µl FB = konsentrasi Fructooligosaccharide 75 µl FC = konsentrasi Fructooligosaccharide 100 µl Menggunakan 48 ekor itik petelur fase grower. Peubah yang diamati meliputi jumlah eritrosit, leukosit, nilai hematokrit, dan kadar hemoglobin. Pengambilan sampel darah dilakukan pada minggu ke-5. Hipotesis yang akan diuji adalah : H 0 : FA = FB = FC = FC = 0 artinya tidak terdapat perbedaan antar perlakuan. H 1 : K FA FB FC 0 atau paling sedikit ada sepasang perlakuan yang tidak sama. Kaidah keputusan : Jika F hitung F tabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H 0 dan tolak H 1. Jika F hitung > F tabel 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H 0 dan terima H 1. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode ortogonal polinomial. Suatu derajat polynomial ke-n digunakan untuk mengetahui
43 hubungan antara peubah respon Y dan peubah predictor X diujikan sebagai berikut : Y = α + β 1 X + β 2 X 2 +. + β n X n Perhitungan untuk mendapatkan koefisien orthogonal polynomial untuk derajat polynomial pertama (linier), derajat polynomial kedua (kuadratik) dan derajat polynomial ketiga (kubik), sebagai berikut : L = a + X 1 Q 1 = b + cx 1 + X i 2 C 1 = d + ex 1 + f X 1 2 + X 1 3 Sumber Tabel 4. Analisis Ragam Sesuai dengan Perbandingan orthogonal polynomial Derajat Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah Statistik Keragaman Bebas (db) (JK) (KT) Uji F Perlakuan t 1 JKP KTP F Linier 1 JKP 1 KTP 1 F 1 Kuadratik 1 JKP 2 KTP 2 F 2 Kubik 1 JKP 3 KTP 3 F 3 Kuartik 1 JKP 4 KTP 4 F 4 Galat Percobaan Sisa JKG KTG Total n - 1 JKT Pengambilan keputusan dapat dilihat dari hasil pembandingan nilai statistik uji F yang telah dihitung dengan nilai kritis. Penentuan derajat polinomial didasarkan pada kontras-kontras ortogonal yang nyata, sehingga akan
didapatkan hubungan fungsi respon antar perlakuan sesuai dengan derajat polinomial yang signifikan. 44