18 III METODE PENELITIAN 3.1 Objek Penelitian 3.1.1 Ternak penelitian Penelitian menggunakan 60 itik lokal jantan asal Gunungmanik, Tanjung Sari, Sumedang yang berumur 35 hari. Kisaran bobot badan itik 0,83-1,17 kg, koefisien variasi 9,15%. 3.1.2 Peralatan dan Bahan Penelitian a. Peralatan 1. Pisau untuk mengiris daun kecubung (Datura metel) 2. Timbangan duduk digital kapasitas 5 kg dengan ketelitian 1 gram untuk menimbang daun kecubung (Datura metel) dan menimbang konsumsi pakan pada saat di kandang 3. Panci untuk tempat merebus daun kecubung (Datura metel) 4. Kompor gas untuk merebus daun kecubung (Datura metel) 5. Kain flanel untuk menyaring larutan daun kecubung (Datura metel) 6. Gelas ukur kapasitas 500 ml dengan ketelitian 10 ml, gelas ukur kapasitas 50 ml dengan ketelitian 1 ml, dan gelas ukur kapasitas 25 ml dengan ketelitian 0,2 ml untuk mengukur larutan (infusa) daun kecubung (Datura metel) 7. Pagar pemisah (sekat) untuk membedakan setiap perlakuan pada saat di kandang
19 8. Gelang kaki untuk menandai itik agar mudah pencatatan 9. Timbangan gantung digital kapasitas 40 kg dengan ketelitian 5 gram untuk menimbang bobot badan itik 10. Tempat minum (modifikasi dari botol plastik bekas) untuk tempat minum pada saat di kandang 11. Tempat pakan untuk tempat pakan pada saat di kandang 12. Keramba (P x L x T) (93,7 cm x 56,5 cm x 28 cm) untuk tempat itik pada saat transportasi 13. Mobil bak terbuka untuk sarana transportasi yang dilengkapi odometer pada panel speedometer mobil 14. Thermohygrometer tipe RC-4H (mini temperature and humidity data logger), untuk mencatat suhu dan kelembaban lingkungan setiap 15 menit 15. Masker untuk biosafety 16. Sarung tangan latex untuk biosafety 17. Kapas dan alkohol untuk membersihkan tempat pengambilan sampel darah (vena pektroralis eksterna) 18. Jarum dan spuit 5 ml untuk mengambil sampel darah 19. Vacumtube EDTA (Etil Diamin Tetra Acetid) 3 ml untuk menampung darah 20. Cooling box untuk menyimpan sampel darah 21. Gelas objek untuk membuat apusan 22. Metil alkohol sebagai cairan fiksasi 23. Giemsa untuk zat warna apusan 24. Minyak imersi untuk melumasi gelas objek 25. Mikroskop untuk mengamati heterofil dan limfosit
20 26. Alat tulis untuk menulis b. Bahan 1. Daun kecubung (Datura metel) yang diambil secara acak 2. Air sumur 3. Alkohol 70% 4. Es batu 3.2 Metode penelitian 3.2.1 Prosedur Penelitian 1) Tahap Persiapan Pembuatan Larutan (Infusa) Daun Kecubung (Datura metel) a. Daun kecubung diperoleh dari sekitar Jatinangor, dipisahkan bagian daun dari batangnya. Daun kecubung diris dengan ukuran 2-4 mm dan selanjutnya di buat infusa dengan menggunakan metode infundasi (Badan POM RI, 2010). Prosedur pembuatan infusa disajikan pada Lampiran 1. b. Infusa yang dihasilkan dimasukan dalam botol plastik tertutup dan disimpan di suhu ruang 2) Tahapan Persiapan Itik jantan terpilih sebanyak 60 ekor diberi tanda gelang kaki, di tempatkan dalam kandang yang telah disekat-sekat sesuai perlakuan. Itik tetap berada dalam kandang bersekat selama 2 hari dengan tujuan untuk beradaptasi dengan lingkungan (sosial) yang baru.
21 3) Tahap Perlakuan a. Sebelum perlakuan diberikan, terlebih dahulu itik dipuasakan dari pakan dan minum selama tiga jam. Infusa daun kecubung sesuai dengan dosis perlakuan diberikan bersama air minum. Itik diberi sebanyak 60 ml infusa daun kecubung sesuai dengan perlakuan satu jam sebelum ditranportasikan. b. Itik dimasukkan ke dalam keramba sesuai dengan tata letak yang telah dirancang. Kapasitas keramba berjumlah 12 ekor itik sehingga satu keramba diisi dengan 4 unit percobaan. c. Itik ditransportasikan menggunakan mobil bak terbuka pada pukul 12.30 WIB dari Gunungmanik, Tanjung Sari, sumedang menuju Kadipaten, Sumedang dan kembali lagi ke Gunungmanik, Tanjung Sari, Sumedang dengan jarak tempuh ± 106 km dengan rata-rata kecepatan 35,33 km/jam. d. Suhu dan kelembaban udara diukur dengan alat thermohygrometer tipe RC- 4H (mini temperature and humidity data logger). Alat tersebut akan mencatata suhu dan kelembaban setiap 15 menit selama perjalanan. e. Jarak tempuh diukur selama perjalanan dengan melihat odometer pada panel speedometer mobil. 4) Pengambilan Sampel Darah Sampel darah diambil segera setelah tiba ditempat tujuan, setiap ulangan diambil satu ekor. Pengambilan sampel darah dilakukan dengan menggunakan jarum dan spuit ukuran 5 ml dari bagian vena pektoralis eksterna yang telah dibersihkan. Darah dimasukkan ke dalam vacumtube EDTA dan sementara disimpan dalam cooling box. Sampel darah akan dianalisis di Laboratorium komersil Multitest Margahayu, Bandung Barat.
22 5) Tahap Analisis Perhitungan jumlah heterofil dan limfosit darah dilakukan dengan menggunakan cara manual, meliputi: a. Membuat sediaan apus darah 1. Dua buah gelas objek disiapkan dalam keadaan bersih 2. Darah ditempatkan ± 2 cm dari ujung gelas objek (sebelah kanan) 3. Pegang bagian ujung lain gelas objek tersebut pada kedua sudutnya (sebelah kiri) dengan ibu jari dan telunjuk tangan kiri. Tangan kanan, pegang gelas objek lainnya (ibu jari dan ke empat tangan kanan memegang pinggir-pinggir gelas objek) dan letakkan bagian ujung depan gelas objek ini pada gelas objek yang tadi (pertama), sehingga membentuk sudut 30 o didepan setetes darah tadi 4. Gerakkan gelas objek yang ditangan kanan ke belakang (sudut tetap 30 o ) sampai menyinggung tetesan darah tadi, sehingga darah menyebar sepanjang sudut antara kedua gelas objek tadi 5. Segera setelah darah menyebar, dengan hati-hati, tanpa mengangkat gelas objek, dan sudut tetap 30 o, gelas objek ditangan kanan didorong kedepan, maka terbentuklah sediaan apusn yang tipis b. Mewarnai sediaan apus darah 1. Sediaan apus darah yang sudah dikeringkan di udara, dimasukkan ke dalam metil alkohol (cairan fiksasi) selama 5 menit 2. Angkat, keringkan, kemudian masukkan ke dalam larutan giemsa, biarkan selama 30 menit.
23 3. Angkat preparat dan cuci kelebihan zat warna dengan menggunakan air keran yang mengalir, keringkan di udara c. Pengamatan sediaan apus (heterofil dan limfosit) 1. Siapka mikroskop dengan objektif 100 x dan okuler 10 x 2. Tetesi preparat dengan minyak imersi 3. Amati, hitung jumlah heterofil dan limfosit (heterofil bergranula netral, halus, sedangkan limfosit berinti bulat, biru tua, sitoplasma sedikit, biru muda) 3.2.2 Peubah yang diamati 1. Jumlah heterofil dengan satuan (%) 2. Jumlah limfosit dengan satuan (%) 3. Rasio heterofil dan limfosit 3.2.3 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan diulang sebanyak 5 kali sehingga terdapat 20 unit percobaan. Masing-masing perlakuan sebagai berikut: P1 = 60 ml air minum P2 = 48 ml air minum + 12 ml (20%) larutan (infusa) daun kecubung P3 = 36 ml air minum + 24 ml (40%) larutan (infusa) daun kecubung P4 = 24 ml air minum + 36 ml (60%) larutan (infusa) daun kecubung
24 Data yang diperoleh dianalisa menggunakan analisis ragam (analysis of variance) dan bila terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel & Torrie, 1991). Model matematik yang digunakan adalah sebagai berikut: Yij = µ + τί + εij Keterangan : Yij = Respon hasil pengamatan karena perlakuan ke-i dengan ulangan ke-j. µ = Rataan umum τί = Pengaruh perlakuan ke-i εij = Pengaruh komponen galat dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j i = 1, 2, 3 dan 4 j = 1, 2, 3, 4 dan 5 Asumsi : εij ~ NID (0, δ 2 ) artinya: 1. Nilai εij menyebar normal dan bebas satu sama lain 2. Nilai harapan εij = 0 atau E (εij) = 0 3. Ragam dari εij =δ 2 atau (εij) 2 = δ 2 Tabel 1. Daftar Ragam Sumber Keragaman DB JK KT Fhit F0,05 Perlakuan 3 JKP KTP KTP/KTG Galat 16 JKG KTG Total 19 JKT Hipótesis yang akan diuji adalah: H0 : P1 = P2 = P3= P4 H1 : P1 P2 P3 P4, atau paling sedikit ada sepasang perlakuan yang tidaksama.
25 Kaidah Keputusan: 1. Jika Fhitung F0,05 artinya perlakuan tidak berpengaruh nyata (non significant), terima H0 dan tolak H1. 2. Jika Fhitung> F0,05 artinya perlakuan berpengaruh nyata (significant), tolak H0 dan terima H1. Apabila hasil yang diperoleh signifikan, maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan uji Jarak Berganda Duncan dengan rumus : LSR = SSR S y Keterangan : S y = Standard error r = Ulangan KTG = Kuadrat Tengah Galat LSR = Least significant range test SSR = Studentized significant range Selisih antar perlakuan (d) dibandingkan dengan LSR d LSR, maka tidak berbeda nyata d > LSR, maka berbeda nyata.