III. METODOLOGI PENELITIAN Metodologi penelitian meliputi aspek- aspek yang berkaitan dengan preparasi sampel, bahan, alat dan prosedur kerja yang dilakukan, yaitu : A. Sampel Uji Penelitian Tanaman Ara diperoleh dari daerah Tanggamus yang diambil pada bulan Agustus 2014 berupa akar keras yang terdapat di dalam tanah. Diambil 5 kg lalu dikeringkan dengan diangin-anginkan dan terlindung dari cahaya matahari secara langsung selanjutnya dipisahkan kulit dari bagian batang dan digiling menjadi serbuk kemudian diayak dengan ukuran ayakan 65 mesh. B. Bahan Penelitian Aquades, heksana, kloroform, etil asetat, butanol, metanol, etanol 70%, serbuk magnesium, serbuk DPPH, serbuk Natrium asetat anhidrat, serbuk AlCl 3, pereaksi sitroborat, serbuk silika, plat KLT GF 254 dan DMSO. C. Peralatan Timbangan, oven, seperangkat alat gelas, lampu UV, spektroskopi UV -VIS, spektrofotometer 1 H-NMR, corong pisah, rotary evaporator, mikropipet dan corong pisah.
28 D. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di : 1. Laboratorium Kimia Organik, Fakultas MIPA, Universitas Lampung. 2. Laboratorium Teranokoko, Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan di Bandar Lampung untuk pengujian HPTLC. 3. Laboratorium Kimia Analitik Universitas Malahayati di Bandar Lampung untuk uji aktivitas antioksidan. 4. Pengujian 1 H-NMR di Laboratorium Kimia Institut Teknologi Bandung, Bandung. Waktu penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai Juni 2015. E. Cara Kerja Isolasi senyawa flavonoid dilakukan dengan metode maserasi dilanjutkan dengan KLT. Jenis KLT yang digunakan adalah KLT GF 254 yang telah diaktivasi dengan pemanasan dalam oven pada suhu 100 o C (Sastrohamidjojo, 1991). 1. Uji Pendahuluan Sejumlah 1,0 g serbuk bahan ditambah 100 ml air panas (80 o C), aduk dan didiamkan selama 5 menit dan saring. Filtrat digunakan sebagai larutan uji. Ditambahkan 5 mg serbuk magnesium dalam 5 ml larutan uji, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol dikocok dengan kuat dan biarkan memisah.
29 Terbentuknya warna kuning hingga merah jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Harborne et al., 1987). 2. Ekstraksi Senyawa Flavonoid Sejumlah 105 g serbuk kering akar tanaman Ara diekstraksi secara maserasi menggunakan heksana sampai diperoleh filtrat jernih. Ampas dikeringkan kemudian diekstraksi dengan etanol 70% berkali-kali hingga diperoleh filtrat jenih. Masing-masing ekstrak dipekatkan dengan penguap vakum putar sehingga diperoleh ekstrak kental (Adam et al., 2002; Fan et al., 2006). Selanjutnya yang digunakan untuk penelitian adalah ekstrak etanol. Bagan isolasi simplisia tersebut seperti terlihat pada Lampiran 1. Ekstrak etanol pekat kemudian diekstraksi dengan heksana lalu dikumpulkan dan dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak kental heksana (Fraksi A). Fraksi air kemudian diekstraksi dengan kloroform selanjutnya dikumpulkan dan dipekatkan hingga diperoleh fraksi kloroform pekat (Fraksi B). Fraksi air diekstraksi kembali dengan etil asetat selanjutnya dikumpulkan dan dipekatkan hingga diperoleh fraksi kental etil asetat (Fraksi C). Fraksi air diekstraksi kembali menggunakan butanol selanjutnya dikumpulkan dan dipekatkan hingga diperoleh ekstrak butanol pekat (Fraksi D)(Harborne, 1987; Qing et al., 2005). Diagram alir dari proses fraksinasi di atas dapat dilihat pada Lampiran 2.
30 a. Uji Kualitatif Flavonoid Masing-masing fraksi (A, B, C dan D) diverifikasi kandungan flavonoidnya dengan mengambil sejumlah 10 mg fraksi kental di atas dan diuji seperti prosedur pada uji pendahuluan. b. Uji Total Flavonoid Uji kuantitatif dilakukan untuk mempertegas keberadaan senyawa flavonoid dalam fraksi di atas, karena bila hasilnya nol berarti bisa saja hasil positif pada uji kualitatif di atas bersifat bias/palsu. Uji kuantitatif dinyatakan sebagai jumlah flavonoid total menggunakan metode yang diperkenalkan oleh Chang et al. (2002). Metode ini menetapkan flavonoid sebagai senyawa kuersetin sehingga dalam perlakuannya menggunakan kuersetin sebagai baku pembanding. Prosedurnya adalah sebagai berikut : Sebanyak 5 mg kuersetin ditimbang dan dilarutkan dalam 10 ml metanol sebagai larutan stok (500 g/ml) lalu diencerkan sedemikian rupa sehingga diperoleh konsentrasi larutan 40 120 g/ml. Ambil 0,5 ml larutan lalu tambahkan 1,5 ml metanol; 0,1 ml AlCl 3 10%; 0,1 ml Na asetat anhidrat 1M dan 2,8 ml aquades. Inkubasi selama 30 menit lalu ukur absorbansinya pada 415 nm. Buat persamaan regresi linearnya.
31 Sampel uji ekstrak kloroform dengan konsentrasi 1000 g/ml dan ekstrak etil asetat 1000 g/ml dilarutkan dalam metanol. Tambahkan 0,1 ml AlCl 3 10 %; 0,1 ml Na asetat anhidrat 1M dan 2,8 ml aquades. Inkubasi selama 30 menit lalu ukur absorbansinya pada 415 nm. Kadar flavonoid total dilakukan dengan mengukur absorbansi senyawa uji lalu diekstrapolasikan menggunakan persamaan regresi linear serangkaian seri kadar kuersetin standar yang telah diukur absorbansinya sehingga kadar total flavonoid sampel ditentukan sebagai kadar kuersetin (mg QE/100 g bahan ). 3. Identifikasi Senyawa Flavonoid Proses KLT dilakukan pada fraksi yang positif mengandung flavonoid dengan prosedur berikut : Cairan pengembang : Dilakukan proses optimasi Jarak rambat : 10 cm Pengembangan : Menaik Penotolan : Bentuk garis Pendeteksi : Sinar UV 254/366 Bercak pada KLT yang terbentuk selanjutnya disemprot dengan pereaksi sitroborat. Bercak positif flavonoid ditandai dengan warna kuning yang berpendar di bawah UV 366 (Markham, 1988).
32 4. Kromatografi Kolom Isolasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom gravitasi. Langkah pertama diawali dengan melakukan impregnasi ekstrak pekat menggunakan eluen yang akan dipakai berupa penambahan silika gel dengan komposisi berat ekstrak dan silika gel (1 : 10). Impregnasi dilakukan agar komponen ekstrak terdistribusi merata dalam silika sehingga proses kromatografi kolom akan lebih teratur dan terkontrol. Eluen yang digunakan sama dengan eluen pada proses KLT yang diperoleh dengan cara optimasi. Hasil elusi ditampung dalam vial vial berukuran 15 ml dan keberadaan senyawa yang tereluen dikontrol dengan melakukan penotolan pada plat KLT. Untuk vial yang memberikan bercak yang sama dapat digabungkan satu sama lain. 5. Penentuan Struktur Flavonoid Penentuan struktur flavonoid dilakukan dengan menginterpretasi data-data dari spektroskopi 1 H-NMR terhadap senyawa uji yang diperoleh dari kromatografi kolom. Penentuan struktur difokuskan pada senyawa yang memiliki indikasi antioksidan yaitu dengan melihat pola kromatogram pada plat KLT yang positif terhadap sitroborat dan larutan DPPH 0,2%.
33 6. Uji Aktivitas Antioksidan a. Uji Kualitatif Sebelum diuji potensi antioksidannya, plat KLT disemprot dengan larutan DPPH 0,2%. Positif antioksidan ditandai dengan perubahan warna larutan DPPH pada bercak KLT dari biru menjadi kuning setelah 30 menit. b. Uji Potensi Antioksidan (IC 50 ) Potensi antioksidan dilakukan dengan tahap berikut : i). Pembuatan larutan DPPH Larutan pereaksi adalah DPPH dalam metanol yang selalu dibuat baru dan dijaga pada suhu rendah dan terlindung dari cahaya. Larutan DPPH dibuat pada konsentrasi yang memberi serapan pada angka sekitar 1,0 yaitu pada konsentrasi 50-100 M (Molyneux, 2004). ii). Pembuatan seri konsentrasi larutan uji Ditimbang 5 mg senyawa uji lalu dilarutkan dalam metanol sehingga diperoleh konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm. Selanjutnya tambahkan DPPH 50 g/ml dengan perbandingan volume yang sama (1:1) pada setiap seri konsentrasi dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 o C. Absorbansi diukur pada 515-517 nm tergantung pada maksimal hasil optimasi. Untuk kontrol positif digunakan larutan vitamin C dengan kadar 2, 5, 7, 10 dan 50 ppm dan diperlakukan sama seperti pada larutan uji
34 Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi nilai IC 50 dengan cara membuat persamaan garis regresi linear, y = bx + a dengan ketentuan y = daya hambat terhadap DPPH dan x= kadar senyawa uji. Prosentase daya hambat dihitung dengan persamaan berikut : % daya hambat = 1 Absorbansi senyawa uji /Absorbansi DPPH x 100 % Nilai IC 50 merupakan hasil ekstrapolasi dari persamaan y = bx + a di atas. Nilai ini menggambarkan kadar suatu senyawa yang dapat menonaktifkan separuh dari kekuatan radikal bebas DPPH. Interpretasi dari IC 50 seperti pada Tabel 6 berikut. Tabel 6. Nilai IC 50 dan potensi antioksidannya (Molyneux, 2004) Kriteria Nilai IC 50 Sangat kuat < 50 ppm Kuat 50 100 ppm Sedang 101 250 ppm Lemah 251 500 ppm Tidak bersifat antioksidan > 500 ppm