DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM...i PRASYARAT GELAR...ii LEMBAR PERSETUJUAN...iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI...iv RIWAYAT HIDUP...v UCAPAN TERIMAKSIH...vi ABSTRAK...vii ABSTRACT...viii RINGKASAN...ix DAFTAR ISI...x DAFTAR TABEL...xi DAFTAR GAMBAR...xii BAB I PENDAHULUAN...1 1.1 Latar Belakang...1 1.2 Rumusan Masalah...4 1.3 Tujuan Penelitian...4 1.3.1 Tujuan Umum...4 1.3.2 Tujuan Khusus...4 1.4 Manfaat Penelitian...5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA...6 2.1 Fruktosa...6 2.2 Anjing...6 2.3 Semen...7 2.4 Pemeriksaan Semen...8 2.4.1 Motilitas Spermatozoa...8 2.4.2 Persentase Hidup Spermatozoa...9 2.4.3 DNA Spermatozoa...9 2.5 Pengencer Semen...12 2.6 Air Kelapa...13 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN...15 3.1 Kerangka Berpikir...15 3.2 Konsep...18 3.3 Hipotesis...18 BAB IV METODE PENELITIAN...19 4.1 Rancangan Penelitian...19 1
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian...19 4.3 Penentuan Sumber Data...19 4.4 Besar Sampel...20 4.5 Variabel Penelitian...20 4.6 Definisi Oprasional Variabel...20 4.7 Bahan Penelitian...21 4.8 Instrumen Penelitian...21 4.9 Prosedur Penelitian...21 4.9.1 Koleksi Spermatozoa dari cauda epididimis...21 4.9.2 Pengencer Semen...22 4.9.3 Pemeriksaan Viabilitas dan Integritas DNA...22 4.10 Analisis Data...24 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN...25 BAB VI SIMPULAN DAN SARAN...34 DAFTAR PUSTAKA...35
DAFTAR TABEL Halaman 4.1 Rancangan Penelitian...19 5.1 Motilitas Spermatozoa Anjing Hasil Koleksi Dari Epididimis Pada Dosis Fruktosa Berbeda..... 25 5.2 Persentase Hidup Spermatozoa Anjing Hasil Koleksi Dari Epididimis Pada Dosis Fruktosa Berbeda... 27 5.3 Integritas DNA Spermatozoa Anjing Hasil Koleksi Dari Epididimis Pada Dosis Fruktosa Berbeda. 30 3
DAFTAR GAMBAR Halaman 3.1 Kerangka Konsep Penelitian... 18 5.1 Spermatozoa Mati dan Hidup Dengan Pewarnaan Eosin Negrosin... 27 5.2 DNA spermatozoa yang mulai terdenaturasi dan DNA normal dengan Pewarnaan Acridine Orange 31
ABSTRAK VIABILITAS DAN INTEGRITAS DNA SPERMATOZOA EPIDIDIMIS ANJING PADA PENGENCER BERBASIS AIR KELAPA MUDA YANG DITAMBAH FRUKTOSA. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi penambahan fruktosa dalam air kelapa muda sebagai bahan pengenceran spermatozoa anjing yang berasal dari cauda epididimis dan pengaruhnya terhadap motilitas, persentase hidup serta integritas DNA pada semen anjing dengan dosis fruktosa 1,00%, 1,25% dan 1,50% serta dilakukan empat waktu pemeriksaan yaitu 0 jam, 6 jam, 12 jam dan 18 jam. Spermatozoa yang didapatkan dari cauda epididimis diencerkan kedalam air kelapa muda yang telah ditambahkan fruktosa. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dosis fruktosa dan waktu pemeriksaan berpengaruh sangat nyata (p<0,01) terhadap motilitas, persentase hidup dan integritas DNA spermatozoa anjing asal cauda epididimis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dosis fruktosa 1,50% mampu mempertahankan motilitas mencapai 70,50 ± 1,29, persentase hidup 76,50 ± 2,28, dan integritas DNA 80,50 ± 0,57. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa penambahan fruktosa pada pengencer air kelapa muda layak digunakan sebagai bahan pengenceran semen anjing yang berasal dari cauda epididimis. Kata Kunci : Cauda Epididimis Anjing, Fruktosa, Viabilitas spermatozoa, Integritas DNA 5
ABSTRACT VIABILITY AND INTEGRITY DNA CANINE EPIDIDYMAL SPERM EFFECTS OF FRUCTOSE IN COCONUT WATER BASED EXTENDER The aim of this study was to evaluate the addition of different dose of fructosa to the coconut water as a material dilution dog spermatozoa derived from cauda epididymis and its effect on motility, percentage of survival and integrity of DNA. Semen were divided into three parts and resuspended in coconut water based extender. The diluents differed in dose of fructose (1.00%, 1.25% and 1.50%). Sperm motility, percentage of live and DNA integrity were evaluated time is 0 hours, 6 hours, 12 hours and 18 hours. The result showed that addition of 1.50% fructose has the best sperm motility of 70.50 ± 1.29, percentage of live 76.50 ± 2.28, and DNA integrity of 80.50 ± 0.57. Based on the results can be concluded that the addition of fructose to the coconut water based extender were efficient in conserving sperm motility, percentage of live and DNA integrity in Canine epididymal sperm Keywords : fructose, canine epididymal, sperm viability, DNA integrity
RINGKASAN Pemanfaatan spermatozoa dari bagian epididimis memberikan harapan baru untuk mengumpulkan material genetik anjing jantan telah mati. Sesungguhnya spermatozoa epididimis pada hewan mati tidaklah juga mati namun mengalami proses kematian yaitu pengurangan dengan derajat berbeda atau hilangnya ciri-ciri fungsi penggunaan energi, sintesis, kerja, dan pertumbuhan sel pada waktu yang berbeda. Dengan kata lain spermatozoa yang diambil setelah dilakukan kastrasi masih hidup dalam beberapa waktu dan lebih lanjut dinyatakan bahwa spermatozoa dari cauda epididimis tetap hidup dengan kualitas yang masih baik untuk jangka waktu tertentu. Penelitian ini mencoba mengembangkan pengencer alternatif yaitu air kelapa muda. Air kelapa muda mengandung gula, mineral, vitamin dan protein yang membantu memberikan nutrisi untuk spermatozoa, namun dari komponen yang ada tersebut masih belum optimal dalam menjaga kualitas dari spermatozoa. Komponen yang sangat berperan dalam menjaga kualitas spermatozoa adalah komponen gula karena merupakan sumber energi bagi spermatozoa, sehingga melihat dari hal tersebut perlu penambahan komponen gula dalam pengencer air kelapa muda. Salah satu komponen gula yang sering digunakan dalam pengencer semen adalah fruktosa. Pengambilan sampel dari cauda epididimis anjing yang telah dilakukan kastrasi rutin di Rumah Sakit Hewan dan Klinik Hewan yang ada di Bali. Namun sebelum dilakukan penelitian, sperma anjing harus diperiksa secara mikrokopis (konsentrasi, motilitas, persentase hidup dan integritas DNA). Dosis fruktosa yang digunakan yaitu 1,00%, 1,25% dan 1,50%,. Faktor yang diamati adalah motilitas, persentase hidup dan integritas DNA setiap 0 jam, 6 jam, 12 jam dan 18 jam setelah penyimpanan. Motilitas dan persentase hidup dilakukan pengamatan langsung di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400X, namun pemeriksaan persentase hidup ditambahkan pewarna eosin negrosin. Bila spermatozoa yang mati ditandai dengan kepala spermatozoa berwarna merah dan yang hidup tidak berwarna, sedangkan pemeriksaan integritas DNA dilakukan di bawah mikroskop fluorosence dengan menggunakan pewarnaan acridine orange. Bila DNA spermatozoa rusak ditandai dengan warna merah sedangkan DNA spermatozoa yang baik berwarna hijau. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dosis fruktosa berpengaruh sangat nyata (p<0,01) terhadap motilitas, persentase hidup dan integritas DNA spermatozoa anjing asal epididimis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dosis fruktosa 1,50% mampu lebih baik mempertahankan kualitas spermatozoa dibandingkan dengan dosis 7
fruktosa 1,00% dan 1,25%. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa penambahan fruktosa dosis 1,50% mampu mempertahankan viabilitas dan integritas DNA spermatozoa epididimis. BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pemeliharaan anjing oleh masyarakat Indonesia sekarang tidak hanya terbatas pada anjing lokal, namun masyarakat mulai memelihara anjing ras berkualitas yang didatangkan dari luar negeri. Dalam proses pemeliharaan tersebut, tidak jarang anjing ras yang dipelihara oleh masyarakat mengalami kematian secara mendadak. Sampai saat ini, tidak banyak yang bisa dilakukan kecuali mengubur atau mengkremasinya, padahal setelah matipun masih ada potensi yang bisa dimanfaatkan yaitu dengan spermatozoa yang dikoleksi dari epididimis. Pemanfaatan spermatozoa dari bagian epididimis memberikan harapan baru untuk mengumpulkan material genetik anjing jantan yang telah mati dengan kisaran waktu pengambilan antara 10 20 jam postmortem. Sesungguhnya spermatozoa asal epididimis pada anjing yang mati tidaklah juga mati namun mengalami proses kematian yaitu pengurangan dengan derajat berbeda atau hilangnya ciri-ciri fungsi penggunaan energi, sintesis, kerja, dan pertumbuhan sel pada waktu yang berbeda (Martinez-pastor et al., 2005).
Cauda epididimis pada anjing jantan yang mati, merupakan sumber spermatozoa (Yu dan Leibo, 2002). Spermatozoa yang berasal dari cauda epididimis telah memiliki kemampuan membuahi oosit yang sama baiknya dengan spermatozoa hasil ejakulasi (Hewitt et al., 2001). Hal ini dikarenakan motilitas spermatozoa dari epididimis adalah 60% sampai 70% dan akrosom utuh sebesar 72% (Bateman, 2001). Puja, et al (2005) menyatakan bahwa spermatozoa yang dikoleksi dari bagian cauda epididimis anjing yang telah mati mampu bertahan hidup mencapai waktu lima hari. Bahkan Yu dan Leibo (2002) melaporkan bahwa spermatozoa motil masih dapat diperoleh dari epididimis anjing setelah delapan hari penyimpanan pada suhu 4 0 C. Spermatozoa hasil koleksi dari epididimis telah dibuktikan fertilitasnya baik secara konvesional seperti inseminasi buatan (IB) maupun dengan teknologi reproduksi modern terbantu seperti fertilisasi in vitro dan intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Beberapa peneliti telah berhasil membuktikan spermatozoa epididimis berhasil digunakan untuk melakukan fertilisasi misalnya pada anjing (Tsutsui et al., 2003; Hori et al., 2004; Kline et al., 2005). Upaya pengolahan spermatozoa yang dikoleksi dari epididimis dalam bentuk semen cair atau beku untuk keperluan aplikasi berbagai teknologi reproduksi, menjadi metode alternatif yang dapat diterapkan pada anjing telah mati yang memiliki kualitas genetik yang unggul. Untuk mempertahankan viabilitas spermatozoa asal epididimis dalam menghadapi kendala waktu dan masalah transportasi, maka kemampuan spermatozoa untuk disimpan supaya tahan lama dapat dilakukan dengan penyediaan 9
pengencer semen yang dapat menjamin kebutuhan fisik dan kimia bagi spermatozoa, sehingga spermatozoa dapat mempertahankan kelangsungan hidupnya. Melalui bahan pengencer tertentu, maka diharapkan selama proses penyimpanan tidak terjadi penurunan viabilitas dan kemampuan spermatozoa secara drastis. Oleh karenanya diperlukan bahan pengencer yang sesuai dengan fungsinya yaitu memberikan perlindungan dan memberikan nutrisi bagi kehidupan spermatozoa selama proses penyimpanan. Banyak tipe pengencer yang berbasis Tris telah berhasil digunakan pada anjing dalam memelihara daya hidup spermatozoa (Iguer-Oada dan Verstegen, 2001; Hori et al., 2005; Tsutsui et al., 2000a; Tsutsui et al., 2000b). Kedalam bahan pengencer tersebut biasanya ditambahkan kuning telur untuk melindungi spermatozoa dari kejutan dingin (cold shock) selama penyimpanan. Namun demikian akhir-akhir ini, penambahan sumber protein asal hewan untuk pengencer mulai dihindari karena dikhawatirkan dapat menularkan penyakit melalui bahan pengencer dari produk hewani. Beberapa peneliti telah mencoba mengembangkan pengencer alternatif yang tidak toksik, isotonik, bersifat sebagai penyangga, harga murah, efektif dan praktis (Cardoso et al., 2004). Air kelapa muda telah diketahui sangat efektif digunakan sebagai pengencer semen pada anjing (Cardoso et al., 2003). Air kelapa muda dapat menyediakan kebutuhan fisik dan kimiawi spermatozoa sehingga dapat mempertahankan fertilitas dan daya hidup spermatozoa (Nunes dan Combarnous, 1995). Air kelapa muda mengandung gula, mineral, vitamin dan protein yang
membantu memberikan nutrisi untuk spermatozoa, namun dari komponen yang ada tersebut masih belum optimal dalam menjaga kualitas dari spermatozoa. Komponen yang sangat berperan dalam menjaga kualitas spermatozoa adalah komponen gula karena merupakan sumber energi bagi spermatozoa, sehingga melihat dari hal tersebut perlu penambahan komponen gula dalam pengencer air kelapa muda. Salah satu komponen gula yang sering digunakan dalam pengencer semen adalah fruktosa (Arifiantini, 2006). Fruktosa mudah didapat dan memiliki keunggulan mudah dimetabolisme spermatozoa sebagai sumber energi (Rasad dan Simanjuntak, 2009). Oleh karena itu, dengan adanya kombinasi air kelapa muda dan fruktosa diharapkan mampu menjadi media untuk pengenceran serta penyimpanan semen cauda epididimis pada anjing dalam jangka waktu panjang. 1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimana pengaruh dosis fruktosa pada pengencer berbasis air kelapa muda terhadap viabilitas spermatozoa yang berasal dari epididimis anjing. 2. Bagaimana pengaruh dosis fruktosa pada pengencer berbasis air kelapa muda terhadap Integritas DNA spermatozoa dari epididimis anjing. 1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum Melihat formulasi fruktosa pada pengencer air kelapa muda terhadap viabilitas dan integritas DNA spermatozoa epididimis anjing. 11
1.3.2 Tujuan Khusus 1. Mengetahui pengaruh dosis fruktosa pada pengencer berbasis air kelapa muda terhadap viabilitas spermatozoa yang berasal dari epididimis anjing. 2. Mengetahui pengaruh dosis fruktosa pada pengencer berbasis air kelapa muda terhadap Integritas DNA spermatozoa yang berasal dari epididimis anjing. 1.4 Manfaat Penelitian Dapat digunakan sebagai bahan pengencer semen alternatif yang murah dan efektif serta dapat memberikan perlindungan dan memberikan nutrisi bagi kehidupan spermatozoa selama proses penyimpanan semen anjing yang berasal dari epididimis.