61 BAB III METODE PENELITIAN A. RANCANGAN PENELITIAN Penelitian ini merupakan uji klinis dengan desain kuasi eksperimental. B. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian dilakukan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta pada bulan September 2015 sampai memenuhi jumlah sampel. C. POPULASI PENELITIAN Populasi target penelitian adalah pasien pneumonia. Populasi terjangkau adalah pasien pneumonia yang menjalani perawatan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta pada bulan September 2015 sampai memenuhi jumlah subyek. D. PEMILIHAN SUBYEK Subyek penelitian adalah pasien pneumonia yang menjalani perawatan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta pada bulan September 2015 sampai memenuhi jumlah sampel. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara purposive sampling yaitu memilih subyek berdasar ciri-ciri yang telah diketahui. Cara randomisasi adalah dengan randomisasi sederhana menggunakan tabel random.
62 E. BESAR SAMPEL Besar sampel ditentukan dengan rumus n = jumlah sampel n = n 1 = ( Z 2PQ + Z P 1 Q 1 +P 2 Q 2 ) 2 ( P 1 -P 2 ) 2 P 1 = proporsi normalisasi kadar prokalsitonin dan TNF-α pada pasien yang menerima deksametason 1x5mg = 80% P 2 = proporsi normalisasi kadar prokalsitonin dan TNF-α pada pasien yang hanya menerima terapi empirik = 20% P = ( P 1 + P 2 ) / 2 = 0.50 Q = (1 - P) = 0.50 α = tingkat kemaknaan, bila α = 0.05 maka Zα = 1,960 β = kekuatan/power = 0.10 maka Zᵦ = 1,282 n = n 1 = ( 1,960 2x0.50x0.50 + 1.282 0.8x0.2 + 0.2x0.8 ) 2 ( 0.8-0.2 ) 2 n = n 1 = 13 Jumlah minimal sampel yang diperlukan adalah 13x2 = 26 Toleransi jumlah sampel 10% tiap kelompok, sehingga jumlah sampel yang diperlukan adalah 30 orang.
63 F. KRITERIA INKLUSI, EKSKLUSI, DAN DISKONTINYU 1. Kriteria Inklusi a. Usia > 18 tahun dengan pneumonia. b. Bersedia ikut dalam penelitian dan menandatangani lembar persetujuan. c. Nilai PORT 70. 2. Kriteria Eksklusi a. Riwayat pemakaian kortikosteroid. b. Menderita hospital acquired pneumonia (HAP). 3. Kriteria Diskontinyu a. Pasien meninggal selama follow up. b. Mengundurkan diri. c. Muncul efek samping terhadap deksametason selama penelitian berlangsung. G. VARIABEL PENELITIAN 1. Variabel tergantung: a. Pemeriksaan kadar prokalsitonin serum. b. Pemeriksaan kadar TNF-α. c. Penilaian perbaikan klinis (kriteria ATS/IDSA 2007). 2. Variabel bebas: Deksametason dosis 1 x 5 mg (1 ml) intravena dengan lama pemberian 5 hari.
64 H. DEFINISI OPERASIONAL VARIABEL PENELITIAN 1. Prokalsitonin Prokalsitonin merupakan suatu protein yang terbentuk dari 116 asam amino, memiliki susunan identik dengan pro-hormone kalsitonin dengan berat molekul 13 kda protein dan disandi oleh gen calsitonin (CALC)-1 di lengan pendek kromosom 11 yang digunakan sebagai tanda spesifik infeksi bakteri. Prokalsitonin diinduksi oleh endotoksin yang dihasilkan bakteri dan juga sitokin inflamasi seperti TNF-α, IL-6 dan IL-1β selama infeksi sistemik (Buchori, 2006). Pengukuran kadar prokalsitonin dilakukan di laboratorium klinik Prodia dengan instrumen VIDAS dengan teknik enzyme-linked fluorescent assay (ELFA) dan skala pengukuran yang diperoleh berupa skala numerik (rasio). 2. Tumor necrosis factors (TNF)-α Tumor necrosis factor-α (TNF-α) merupakan suatu protein signaling cell (sitokin) yang meningkat dan berperan penting pada proses inflamasi (Chow et al 2008). Proses inflamasi pada pneumonia terjadi peningkatan TNF-α akibat pengenalan bakteri yang mengandung PAMP oleh TLR yang mengaktivasi sel (Moldoveanu et al 2009). Pengukuran kadar TNF-α dilakukan di laboratorium klinik Prodia dengan metode ELISA, satuan yang diperoleh pg/ml dan skala pengukuran yang diperoleh berupa skala numerik (rasio).
65 3. Penilaian perbaikan klinis Perbaikan klinis pasien pneumonia dapat dinilai berdasarkan kriteria kondisi klinik stabil menurut criteria Halm yaitu tanda vital stabil dalam waktu 24 jam. Tanda ini meliputi suhu tubuh aksiler < 37,8 o C, laju pernapasan 24 kali per menit, denyut jantung 100 kali per menit, tekanan darah sitolik 90 mmhg, dan SO 2 90% atau tekanan parsial oksigen arteri (PaO 2 ) 60 mmhg saat bernapas dengan oksigen ruangan, status mental normal dan mampu mempertahankan asupan oral yang memadai (Akram et al 2013). Dikatakan membaik apabila memenuhi semua kriteria tersebut diatas atau minimal memenuhi 6 kriteria. Alat ukur yang digunakan berupa tabel, satuan berupa jawaban ya atau tidak dan skala pengukuran yang diperoleh berupa skala kategorik (nominal). 4. Deksametason Kortikosteroid merupakan inhibitor yang sangat kuat untuk inflamasi. Pengobatan dengan kortikosteroid dosis rendah dapat mengatur penurunan transkripsi sitokin proinflamasi, yang mencegah perpanjangan respon sitokin dan mungkin mempercepat resolusi sistemik dan inflamasi paru pada pneumonia. Deksametason merupakan salah satu kortikosteroid sintetis terampuh yang bekerja long acting. Deksametason memiliki efek antiinflamasi yang kuat dan efek mineralokortikoid lemah dibandingkan dengan kortikosteroid lain, sehingga mencegah gangguan reabsorpsi natrium
66 dan keseimbangan air (Goldfien, 2005). Deksametason diberikan dalam bentuk injeksi dengan dosis 1x5mg (1ml) intravena selama 5 hari. I. INSTRUMEN PENELITIAN 1. Tingkat keparahan pneumonia menggunakan skoring PSI berdasarkan PORT dan CURB-65. 2. Pengukuran prokalsitonin menggunakan teknik enzyme-linked fluorescent assay (ELFA) yang dilakukan di laboratorium klinik Prodia. 3. Pengukuran kadar TNF-α menggunakan metode ELISA yang dilakukan di laboratorium klinik Prodia. 4. Penilaian perbaikan klinis melalui kriteria klinis stabil. J. PROSEDUR PENGUMPULAN DATA 1. Pasien yang datang ke RSUD Dr. Moewardi Surakarta yang telah terdiagnosis pneumonia sebagai subyek diberikan penjelasan tentang tujuan penelitian. 2. Subyek yang bersedia ikut dalam penelitian diminta untuk menandatangani lembar persetujuan (informed concern). 3. Subyek yang memenuhi kriteria inklusi diberikan edukasi, dicatat identitas, riwayat merokok, penyakit lain yang diderita, dan lain-lain pada formulir yang disediakan. Data awal subyek diperoleh dari anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah dan foto toraks. Subyek kemudian dinilai jumlah skor PSI
67 berdasarkan PORT kemudian diambil darah vena untuk memeriksa kadar prokalsitonin dan kadar TNF-α. 4. Selanjutnya subyek dibagi menjadi 2 grup, grup pertama mendapat deksametason dosis 1 x 5 mg (1 ml) secara intravena selama 5 hari, grup kedua hanya mendapat terapi empirik selama 5 hari. 5. Antibiotik dan terapi suportif lainnya diberikan sesuai terapi empirik atau definitif apabila sudah didapatkan data kultur. 6. Pasien kemudian di follow-up sampai kondisi klinis stabil. Perbaikan kondisi klinis pasien dinilai pada hari ke-5 berdasarkan kriteria: tanda vital stabil dalam waktu 24 jam, mampu mempertahankan intake oral dan status mental normal. 7. Darah vena pasien diambil lagi untuk pemeriksaan kadar prokalsitonin dan kadar TNF-α. 8. Respons terapi setelah pemberian deksametason diukur berdasarkan penurunan kadar prokalsitonin serum dan TNF-α serum serta perbaikan klinis pasien. K. TEKNIK PEMERIKSAAN 1. Penilaian skor PSI dan CURB-65 Subyek dicatat identitas, dilakukan anamnesis, pemeriksaan fisik, pemeriksaan darah rutin, kimia darah, elektrolit darah, analisis gas darah dan
68 foto toraks. Kemudian dihitung skor PSI berdasarkan PORT dan skor CURB- 65. 2. Pemeriksaan kadar prokalsitonin Media yang diteliti adalah darah vena. Pengambilan darah dilakukan 2 jam setelah pasien masuk IGD dan darah yang diambil adalah darah vena kurang lebih 3 cc. Darah kemudian di sentrifus dan diambil serumnya untuk diperiksa. Satuan untuk prokalsitonin adalah ng/ml. Pengukuran prokalsitonin menggunakan teknik enzyme-linked fluorescent assay (ELFA). 3. Pemeriksaan kadar TNF-α Media yang diteliti adalah darah vena. Pengambilan darah dilakukan 1-2 jam setelah pasien masuk IGD dan darah yang diambil adalah darah vena kurang lebih 5 cc. Darah dimasukan ke dalam tabung EDTA kemudian dibolak-balik secara perlahan. Prosedur pemeriksaan kadar TNF-α. a. Tempatkan semua reagen dan sampel pada suhu kamar sebelum digunakan dengan jumlah rangkap dua. b. Siapkan semua reagen dan standar kerja sesuai petunjuk. c. Hapus strip lempeng mikro yang berlebih dari bingkai lempeng, kembalikan ke kantong foil berisi paket pengering, tutup kembali. d. Tambahkan 50 μl Assay Diluent HD1-11. Assay Diluent HD1-11 berisi presipitat. Aduk rata sebelum dan selama digunakan.
69 e. Tambahkan 200 μl standar, sampel atau kontrol per cekungan. Tutup dengan strip perekat yang disediakan. Inkubasi selama 3 jam dalam suhu ruang. Pencucian a. Bersihkan cairan dari cekungan dengan aspirasi atau membalik lempeng dan menuang isinya. b. Hapus kelebihan cairan dengan memegang lempeng dan mengetuk lempeng secara terbalik pada handuk kertas 5 kali. c. Isi cekungan dengan 400 µl Wash Buffer menggunakan botol semprot, pipet multi channel, dispenser, atau autowasher. d. Hapus cairan dari cekungan dengan aspirasi atau membalik piring dan menuang isinya. e. Tambahkan 200 μl TNF-α HS Conjugate pada setiap cekungan. Tutup dengan strip perekat baru. Inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. f. Tambahkan 50 μl dari Substrate Solution untuk setiap cekungan. Tutup dengan strip perekat baru. Inkubasi selama 1 jam di suhu ruang. g. Tambahkan 50 μl Amplifier Solution untuk setiap cekungan. Tutup dengan strip perekat baru. Inkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. h. Tambahkan 50 μl Stop Solution pada tiap cekungan. i. Tentukan kepadatan optik masing-masing cekungan dalam 30 menit, gunakan set pembaca lempeng 490 nm.
70 L. ETIKA PENELITIAN Penulis mengajukan persetujuan penelitian ke Panitia Kelaikan Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta sebelum dilakukan penelitian. Setiap subyek penelitian diberikan penjelasan yang benar dan terperinci tentang tujuan dan manfaat penelitian sebelum dilakukan prosedur penelitian, setelah subyek mengerti dan setuju mengikuti penelitian, subyek diminta menandatangani lembar persetujuan dan isian data pasien. M. ANALISIS DATA Analisis data dilakukan dengan memakai SPSS 17 for Windows. 1. Uji Beda Uji beda adalah hasil uji untuk melihat perbedaan dua sampel yaitu sampel perlakuan dengan pemberian deksametason dan sampel kontrol. Penelitian ini menggunakan sampel berpasangan dengan uji parameter t test (Dahlan, 2011). Batas kemaknaan: - nilai p > 0,05: tidak bermakna - nilai p 0,05: bermakna - Nilai p < 0,01: sangat bermakna 2. Korelasi Korelasi merupakan suatu metode untuk mencari hubungan timbal balik antara dua variabel. Hubungan antara dua variabel numerik dan kategorik
71 akan dilakukan dengan fisher s exact. Hubungan dua variabel atau lebih dinyatakan positif apabila satu variabel ditingkatkan maka akan meningkatkan variabel yang lain dan sebaliknya apabila satu variabel diturunkan maka akan menurunkan variabel yang lain. Hubungan dua variabel atau lebih dinyatakan negatif apabila nilai satu variabel dinaikkan maka akan menurunkan variabel yang lain dan sebaliknya apabila satu variabel diturunkan maka akan menaikkan variabel yang lain. Batas kemaknaan: - nilai p 0,05: terdapat korelasi yang bermakna antara dua variabel yang diuji. - nilai p > 0,05: tidak terdapat korelasi yang bermakna antara dua variabel yang diuji.
72 ALUR PENELITIAN Pasien datang di IGD Pneumonia Anamnesis, pemeriksaan fisik, laboratorium darah, foto toraks Penjelasan, informed concern Tidak setuju ikut penelitian Setuju ikut penelitian Eksklusi Pemeriksaan kadar prokalsitonin Pemeriksaan kadar TNF-α Penilaian klinis dan laboratorium Analisis statistik Antibiotik + Deksametason 1x5mg (IV) selama 5 hari Antibiotik selama 5 hari Penilaian perbaikan klinis (kriteria klinis stabil) Pemeriksaan prokalsitonin Pemeriksaan TNF-α Gambar 2.9. Alur penelitian peran deksametason terhadap kadar prokalsitonin, TNF-α plasma dan perbaikan klinis pasien pneumonia.