METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan, mulai Maret 2010 sampai dengan Agustus 2010 di laboratorium Terpadu Bagian Mikrobiologi Medik dan laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25 ekor ayam betina petelur tipe ISA Brown berumur 20 minggu, telur ayam ISA Brown, isolat bakteri Enteropathogenic Eschericia coli (EPEC) dan Salmonella Enteritidis dari Laboratorium Bakteriologi FKH IPB, virus Avian Influenza H5N1, vaksin Avian Influenza H5N1 (IPB-Shigeta), media cair Brain Heart Infusion (BHI) Broth, NaCl fisiologis, Blood Agar (BA), MilliQ, agarose, Phosphat Buffer Saline (PBS), Na Acid, Freund s Adjuvant Complete dan Incomplete, alkohol 96%, garam NaCl, pakan ayam komersial (Gold Coin 105 Layer). Alat yang digunakan adalah centrifuse, vortex, tabung reaksi, wadah plastik, amplas, tabung Erlemeyer, gelas objek, tisu, gelas ukur, penangas air, mikropipet, spoit, tip mikropipet, pipet, microplate V bottom, kertas saring, microtube, puncher, inkubator, kompor gas, kandang hewan percobaan. Metode Penelitian Tahap Kultur Biakan Antigen Murni untuk Dijadikan Vaksin Inaktif Antigen yang digunakan untuk vaksinasi adalah bakteri EPEC dan S. Enteritidis yang telah dibiakkan pada media agar (Blood Agar). Isolat bakteri kemudian dibiakkan pada BHI Broth sebanyak 50 ml dan diinkubasi selama 24 jam. Bakteri yang telah dibiakkan di BHI Broth disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan pelet dicuci dengan 10 ml NaCl fisiologis sebanyak 3 kali. Disentrifugasi kembali selama 15 menit pada kecepatan 5000 rpm. Pelet ditampung dan ditambahkan 10 ml NaCl
16 fisiologis, kemudian pada tabung yang berbeda sebanyak 20 ml NaCl fisiologis dihomogenkan dengan campuran pelet dan distandarkan dengan standar Mac Farland II. Homogenan ditangas dalam penangas air pada suhu 60 C selama 2 jam untuk menginaktifkan bakteri. Penambahan adjuvant dilakukan dengan mencampurkan homogenan antigen dengan Freund s Adjuvant Complete atau Incomplete dengan perbandingan 1:1, kemudian dihomogenkan. Tahap Pemberian Antigen Ayam dibagi menjadi 2 kelompok yaitu 22 ekor kelompok diberi antigen dan 3 ekor tidak diberi antigen sebagai kontrol negatif. Pemberian bakteri dilakukan sebanyak 4 kali dengan interval 1 minggu. Pada minggu pertama, untuk pemberian bakteri (E. coli dan S. Enteritidis) tidak menggunakan adjuvant. Antigen tersebut disuntikan secara intravena sebanyak 0,5 ml per ekor. Minggu kedua, antigen tersebut dicampur dengan Freund s Adjuvant Complete, sedangkan minggu ketiga dan keempat menggunakan Freund s Adjuvant Incomplete diberikan sebanyak 1 ml per ekor secara subkutan. Vaksin AI diberikan pada minggu pertama dan minggu keempat sebanyak 1 ml per ekor secara subkutan. Ayam yang digunakan adalah ayam betina jenis petelur (ISA Brown) usia 20 minggu yang siap bertelur. Ayam dipelihara dalam kandang baterai dan diberi pakan komersial. Tahap Pembuatan Telur Asin Telur ayam kelompok yang diberi antigen dipilih pada rentang waktu yang telah diketahui positif mengandung IgY anti EPEC, Salmonella Enteritidis, dan AI (Manggung 2010). Telur koleksi direndam dalam larutan garam 1:2 (garam: air). Sebelum perendaman dilakukan, kerabang telur digosok dengan menggunakan amplas halus hingga terbuka pori-porinya. Kemudian disiapkan air sebanyak satu liter. Air tersebut dipanaskan bersama garam sesuai dengan konsentrasi yang diharapkan, yaitu 500 gram hingga larut. Kemudian larutan garam didinginkan dan ditaruh dalam wadah plastik. Telur yang telah diamplas dimasukkan ke dalam larutan garam dan ditutup rapat. Telur direndam dalam waktu yang bertingkat yaitu 10 hari, 15 hari, dan 20 hari. Pada hari kesepuluh, diambil 4 butir telur. Sebanyak 3 butir diambil kuning
17 telurnya untuk diuji keberadaan IgY dan 1 butir direbus untuk uji organoleptik. Uji organoleptik dilakukan untuk membuktikan rasa asin telah ada pada telur. Demikian pula pada hari kelima belas dan hari kedua puluh, diambil 4 butir telur dan dilakukan uji yang sama pada telur asin dengan perendaman 10 hari. Tahap Uji Keberadaan Antibodi Spesifik dengan Agar Gel Precipitation Test (AGPT) dan Hemagglutination Inhibition Test (HI Test) Tahap Uji Keberadaan Antibodi Spesifik dengan Agar Gel Precipitation Test (AGPT) Agar gel dibuat dengan melarutkan 1% agarose, Na Acid 0,001 gr/ ml, ½ bagian volume MilliQ dan ½ bagian volume PBS ph 7,4. Apabila sediaan agar gel yang dibutuhkan sebanyak 8 ml, maka agarose yang dibutuhkan adalah sebanyak 0,08 gr, Na Acid 0,008 gr, 4 ml MilliQ, dan 4 ml PBS. Bahan-bahan tersebut dipanaskan dengan penangas air hingga larut dan warna larutan menjadi jernih. Sebanyak 4 ml agar gel dituangkan pada gelas objek dan ditunggu hingga mengeras. Setelah agar gel mengeras, dibuat sumursumur dengan puncher. Masing-masing agar gel, pada sumur tengah dimasukan 25 µl antigen dan pada sumur sekelilingnya dimasukkan 25 µl kuning telur asin segar. Gelas objek dimasukkan ke dalam kotak tertutup yang telah diberi tisu yang dibasahi dengan aquabidest agar terjaga kelembabannya. Reaksi dibaca setelah 24 jam, reaksi positif ditunjukkan dengan adanya garis presipitasi (garis buram putih) pada daerah antara sumur antigen dengan sumur kuning telur asin segar. Hal ini menandakan bahwa antigen dan antibodi tersebut homolog. Tahap Uji Keberadaan Antibodi Spesifik dengan Hemagglutination Inhibition Test (HI Test) Tahap Preparasi RBC (Red Blood Cells) 1% Darah ayam yang sebelumnya telah dicampur dengan Na sitrat 3,8% dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dimasukkan PBS hingga penuh. Suspensi darah disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 2000 rpm. Supernatan yang dihasilkan diambil kemudian tabung berisi pelet darah kembali diberi PBS hingga penuh dan dihomogenkan dengan cara
18 membentuk angka 8. Suspensi kembali disentrifugasi pada kecepatan 200 rpm selama 10 menit. Pencucian pelet tersebut dilakukan tiga kali. Setelah supernatan terakhir dibuang, pelet yang dihasilkan diukur volumenya dengan menggunakan pipet. Pelet darah diencerkan menjadi konsentrasi 50% atau 40% (v/v) dan dihomogenkan. Digunakan pipa kapiler untuk mengambil suspensi dan disentrifugasi untuk mengonfirmasi konsentrasi pengenceran. Suspensi yang telah dikonfirmasi konsentrasinya tersebut kembali diencerkan menjadi konsentrasi 5% kemudian dikonfirmasi kembali dengan menggunakan pipa kapiler. Selanjutnya diencerkan kembali menjadi konsentrasi 1% dan disimpan pada suhu 4 C (CVI 2010). Tahap Uji Hemaglutinasi (HA) Uji HA digunakan untuk membuat virus AI standard 4 HAU. Pengujian HA mengginakan microplate V bottom. Sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam sumur baris A hingga F, kolom 2 hingga 12. Dimasukkan masing-masing 25 µl sampel virus AI ke dalam sumur A1 hingga E1 serta A2 hingga E2 kemudian dihomogenkan sebanyak 5x dengan menggunakan mikropipet. Selanjutnya 25 µl PBS dimasukkan pada sumur B2 dan dihomogenkan sebanyak 10x dengan menggunakan mikropipet kemudian diambil kembali sebanyak 25 µl sampel pengenceran (sebanyak volume PBS yang dimasukkan). Sebanyak 75 µl PBS dimasukkan pada sumur C2, 125 µl PBS ke dalam sumur D2, 175 µl PBS ke dalam sumur E2 dan dilakukan prosedur yang sama dengan sumur B2. Selanjutnya dilakukan pengenceran kelipatan dua sebanyak 25 µl dari sumur A2 E2 hingga sumur A12 E12. Sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke semua sumur kemudian dimasukkan 25 µl RBC 1% ke dalam setiap sumur. Microplate dihomogenkan dengan menggunakan plate shaker selama 10 detik kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 4 C. Hasil titer virus AI yang terbaca kemudian dilakukan pengenceran pada virus AI tersebut dengan menggunakan rumus: Titer HAU/4 = X kali faktor pengenceran untuk 4 HAU = Y µl antigen + Z µl PBS
19 Hasil pengenceran virus AI standard dikonfirmasi dengan mentitrasi kembali sesuai dengan prosedur uji HA (CVI 2010). Tahap Hemagglutination Inhibition Test Uji serologis ini digunakan untuk mendeteksi antibodi terhadap antigen virus H5N1 yang diketahui titernya sekaligus mengetahui nilai titer IgY spesifik pada kuning telur asin. Sampel kuning telur asin sebelumnya diencerkan dengan menggunakan PBS dengan perbandingan 1:2 kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Selanjutnya larutan kuning telur asin tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit dan diambil supernatannya (Soejoedono 2005). Pengujian HI menggunakan microplate V bottom. Semua sumur diisikan 25 µl PBS dengan menggunakan mikropipet. Selanjutnya pada sumur 1diisi supernatan kuning telur asin sebanyak 25 µl dan dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet. Selanjutnya dilakukan pengenceran kelipatan dua sebanyak 25 µl hingga sumur 8. Semua sumur diisikan virus AI standard 4 HAU sebanyak 25 µl kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 4 C. Selanjutnya semua sumur diisikan masing-masing 25 µl RBC 1%, dihomogenkan dengan cara digoyang-goyangkan dan diinkubasi pada suhu 4 C selama 60 menit. Reaksi dibaca dengan cara menegakkan microplate 90 (CVI 2010).