MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Terpadu, Laboratorium Ruminansia Besar, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Terpadu, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan November 2011 hingga Maret 2012. Materi Bahan yang digunakan dalam pembuatan salami ini adalah daging sapi segar yang berasal dari sapi Brahman Cross dengan lama post mortem 24 jam, lemak sapi, kultur Lactobacillus plantarum 2C12 dan Lactobacillus acidophilus 2B4, susu skim, gula pasir, garam, Nitrit Polken Salt (NPS), lada halus, jahe halus, pala halus, dan selongsong sosis. Bahan yang dibutuhkan untuk pengujian kimia dan asam amino adalah selenium, de Man Rogosa Sharp Broth (MRS-B), de Man Rogosa Sharp Agar (MRS-A), H 2 SO 4, NaOH, H 3 BO 3, Brom Cresol Green Methyl, HCl 0,1 N, kapas, hexana, larutan standar asam amino 0,5 µmol/ml, Metanol, Na-asetat, nitrogen dan 250 μl pereaksi Optaldehida (OPA). Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cutter, mincer, food processor, termometer, stuffer, casing berdiameter 6 cm, wadah plastik, talenan, pisau, panci, peralatan dapur, labu kjeldhal, labu erlenmeyer, oven, selongsong penyari, labu penyari, kondensor, rotavapor, pembakar bunsen, mikropipet, tip, labu destruksi, labu penyuling, labu lemak, desikator, hot plate, alat destilasi, pompa vakum, gelas piala, cawan, gegep, sudip, tabung reaksi, tabung ulir, tabung vial 1 ml, syringe 100 µl, membran milipore 0,45 mikron, komputer, dan perangkat High Performance of Liquid Chromatography (HPLC). Prosedur Penelitian ini terdiri dari dua tahap. Penelitian pendahuluan berupa pembiakan kultur starter dan penelitian utama yang meliputi pembuatan sosis fermentasi dan analisis kimia serta asam amino sosis fermentasi. 17
Penelitian Pendahuluan Penelitian diawali dengan melakukan penyegaran kultur Lactobacillus plantarum 2C12 dan Lactobacillus acidophilus 2B4 pada media de Man Rogosa Sharp Borth (MRS-B). Sebanyak 2% kultur hasil penyegaran diinokulasikan pada 20% larutan susu skim dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, yang disebut sebagai kultur induk. Sebanyak 2% kultur induk diinokulasi pada larutan susu skim untuk dijadikan kultur antara. Sebanyak 2% kultur antara diinokulasi kembali sebagai kultur kerja. Kultur kerja ditumbuhkan pada media susu dan dihitung viabilitasnya. Diagram alir pembiakan kultur dapat dilihat pada Gambar 5. Kultur murni L. plantarum 2C12 dan L. acidophilus 2B4 Penyegaran pada media de Man Rogosa Sharp Broth (MRS-B) Sebanyak 2% diinokulasikan ke dalam larutan susu skim steril Diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam (kultur induk) Ditumbuhkan 2% dari kultur induk ke larutan susu skim, diinkubasi 37 C selama 24 jam (kultur antara) Ditumbuhkan 2% dari kultur antara ke larutan susu skim, diinkubasi 37 C selama 24 jam (kultur kerja) Ditumbuhkan pada media MRS-A Dihitung populasi Populasi 10 8 CFU/ml Populasi < 10 8 CFU/ml Kultur kerja Gambar 5. Pembiakan Kultur Sumber: Arief (2000) 18
Penelitian Utama Pembuatan Sosis Fermentasi Proses pembuatan salami yaitu daging sapi beku digiling, begitu pula dengan lemak beku. Hasil gilingan tersebut dicampur dengan gula pasir, garam, NPS, jahe halus, pala halus, ladah putih dan dengan atau tanpa kultur starter (Lactobacillus plantarum 2C12 atau Lactobacillus acidophilus 2B4). Adonan yang telah jadi dimasukkan ke dalam selongsong, lalu dilakukan pemeraman selama 24 jam pada suhu ruang. Pengasapan dilakukan selama tiga jam selama tiga hari dengan suhu 28-30 o C. Pembuatan sosis fermentasi ini dilakukan dengan tiga kali ulangan dengan tiga perlakuan. Proses pembuatan sosis dapat dilihat pada Gambar 6. Daging 80% + lemak 20% Digiling Dibekukan selama 24 jam Pencampuran dengan penambahan kultur (kecuali kontrol) dan bumbu Dimasukkan ke dalam casing pada suhu 2 C Pemeraman (suhu ruang, 24 jam) Pengasapan pada suhu 28-30 C selama 3 jam selama 3 hari Dilakukan fermentasi pada suhu ruang (24 C) selama 3 hari Sosis fermentasi Gambar 6. Pembuatan Sosis Fermentasi Sumber: Arief (2000) 19
Analisis Kimia Pengujian analisis kimia dilakukan pada daging segar dan sosis fermentasi. Analisis kimia yang diuji adalah sebagai berikut. Kadar Air (Association of Official Analytical Chemistry, 1995). Kadar air ditentukan secara langsung dengan menggunakan oven pada suhu 105 o C. Sampel awal sebanyak lima gram dikeringkan selama 15 jam dalam oven sampai beratnya tetap. Sampel kering ditimbang, kemudian dihitung dengan rumus berikut. Kadar air (% bb) = sampel awal-sampel kering sampel awal Kadar Abu (Association of Official Analytical Chemistry, 1995). Sampel yang telah dioven pada pengukuran kadar air dan telah diketahui kadar airnya, kemudian dipanaskan di hot plate pada suhu 400 C hingga asap hilang. Selanjutnya sampel didinginkan di dalam desikator. Kemudian sampel dimasukkan bersama cawan ke dalam tanur dengan suhu 500 C hingga warna menjadi abu. Setelah pengabuan selesai, sampel didinginkan pada desikator dan ditimbang. Kadar abu diperoleh dengan perhitungan berikut. Kadar abu (% bb) = bobot abu bobot sampel Kadar abu (% bk) = 100 100 - kadar air Kadar Protein (Association of Official Analytical Chemistry, 1995). Kadar protein dalam sampel dianalisis dengan menggunakan metode Kjeldahl yang merupakan analisis kadar total N. Sekitar 0,1 gram sampel dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 100 ml lalu ditambahkan selenium dengan perbandingan 1:1 dengan sampel dan 3 ml H 2 SO 4 pekat. Sampel didestruksi hingga larutan jernih. Labu destruksi didinginkan kemudian ditambahkan 50 ml aquadest dan 20 ml NaOH 40%. Larutan tersebut kemudian didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam labu erlenmeyer yang berisi campuran 10 ml H 3 B0 3 2% dan 2 tetes indikator Brom Cresol Green Methyl Red berwarna merah muda. Setelah volume hasil tampungan menjadi 10 ml dan berwarna hijau kebiruan, destilasi dihentikan dan dititrasi dengan larutan 20
HCl 0,1 N hingga kembali menjadi warna merah muda. Perlakuan yang sama diujikan terhadap blanko. % N = (S-B) N HCl 14 w 1000 2,5 Kadar protein (% bb) = 6,25 % N Kadar protein (% bk) = 100 100 kadar air Keterangan: S : volume titran sampel (ml) B : volume titran blanko (ml) W : bobot sampel kering (mg) Kadar Lemak (Association of Official Analytical Chemistry, 1995). Sampel ditimbang kemudian dihancurkan. Sampel dibungkus dengan kertas saring, selanjutnya diletakkan dalam alat ekstraksi Soxhlet. Dilakukan ekstraksi dengan pelarut hexana selama 6 jam. Lemak yang tertampung dalam labu dikeringkan dalam oven 105 C hingga berat konstan, kemudian ditimbang. Kadar lemak dihitung dengan rumus: Kadar lemak (% bb) = bobot lemak terekstrak bobot sampel Kadar lemak (% bk) = 100 100 kadar air Kadar Karbohidrat (Winarno, 1992). Kadar karbohidrat dihitung secara by difference, dengan perhitungan sebagai berikut: Kadar karbohidrat (% bb) = 100% - % (air + abu + protein + lemak) Kadar karbohidrat (% bk) = 100 100 kadar air Analisis Komposisi Asam Amino Analisis ini sesuai prosedur Nur et al. (1992) yang diawali oleh hidrolisis sampel dengan asam. Langkah pertama yang dilakukan adalah dengan melakukan preparasi sampel, yaitu dengan memasukkan sampel yang mengandung 3 mg protein 21
ke dalam tabung ulir dan ditambahkan 1 ml HCl 6 N. Tabung ulir yang mengandung larutan sampel dialirkan gas nitrogen selama 0,5-1 menit dan tabung segera ditutup. Tabung yang telah tertutup dimasukkan ke dalam oven pada suhu 110 C selama 24 jam untuk tahap hidrolisis. Sampel yang telah dihdrolisis, didinginkan pada suhu kamar dan larutan dipindahkan secara kuantitatif ke labu rotary evaporator. Tabung ulir dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N sebanyak 2-3 kali. Larutan bilasan digabung ke labu rotary evaporator. Sampel dikeringkan dengan rotary evaporator. Sampel yang telah kering ditambah dengan HCl 0,01 N dan sampel siap untuk dianalisis menggunakan HPLC. Langkah kedua adalah pembuatan pereaksi OPA dengan cara 50 mg OPA dilarutkan dalam 4 ml metanol dan ditambahkan merkaptoetanol. Campuran dikocok perlahan dan ditambahkan larutan brij-30 30% serta buffer borat. Larutan disimpan dalam botol berwarna gelap pada suhu 4 C dan akan stabil selama 2 minggu. Langkah berikutnya adalah menganalisis asam amino, yaitu dengan dilarutkannya sampel yang telah dihidrolisis dalam 5 ml HCl 0,01 N kemudian disaring dengan kertas saring milipore. Buffer Kalium Borat ditambahkan ph 10,4 dengan perbandingan 1:1 ke dalam vial kosong yang bersih kemudian dimasukkan 10 µl sampel dan ditambahkan 25 µl pereaksi OPA. Larutan dibiarkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Larutan diinjeksikan ke dalam kolom HPLC sebanyak 5 µl kemudian ditunggu hingga pemisahan semua asam amino selesai. Waktu yang diperlukan sekitar 25 menit. Kemudian dilakukan perhitungan dengan rumus berikut: Konsentrasi asam amino (µmol AA) sampel = area AA sampel konsentrasi standar konsentrasi tera area AA standar Persen asam amino dalam sampel = µmol AA Mr AA 100 µg sampel Keterangan : konsentrasi standar = 0,5 μmol/ml volume tera = 10 ml Rancangan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang dilakukan dalam pengujian kimiawi adalah rancangan acak lengkap. Perlakuan yang diberikan adalah penambahan bakteri 22
Lactobacillus plantarum 2C12, Lactobacillus acidophilus 2B4 dan kontrol (tanpa penambahan kultur). Hasil yang diamati adalah kandungan nutrisi (kadar air, abu, protein, lemak, karbohidrat). Model rancangan untuk pengujian kandungan nutrisi dapat dituliskan sebagai berikut: Yij = µ + Bi + εij Keterangan: Yij : hasil pengamatan pada perlakuan pemberian kultur ke i dan ulangan ke j terhadap sosis fermentasi µ : nilai rata-rata kandungan nutrisi sosis fermentasi Bi : pengaruh perlakuan penambahan kultur terhadap sosis fermentasi εij : pengaruh galat percobaan pada perlakuan penambahan kultur ke-i dan ulangan ke-j terhadap sosis fermentasi Data diolah dengan Analysis of Variance (ANOVA). Jika pada analisis ragam perlakuan menunjukkan pengaruh yang nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey. Pengujian kualitas asam amino dilakukan secara komposit pada ketiga sosis fermentasi, kemudian dianalisis secara deskriptif. Perlakuan yang dibandingkan adalah sosis fermentasi dengan penambahan Lactobacillus plantarum 2C12, sosis fermentasi dengan penambahan Lactobacillus acidophilus 2B4 dan sosis fermentasi kontrol. 23