Topik 6 Replikasi DNA

Topik 6 Replikasi DNA Telah dimakiumi bahwa suatu material genetik hams memenuhi syarat a.l. menyandi,sintesis protein, self-replicate dan berlokasi di dalam kromosom/intil sel. Pada topik kali ini akan dibahas proses replikasi DNA sebagai suatu material genetik. 6.1. Semikonservatif Pada tahun 1953 Watson-Crick telah mengisyaratkan bahwa proses replikasi DNA berlangsung dengan cara mengurai pilinan kedua utas DNA, sehingga masingmasing utas DNA akan bertindak sebagai cetakan (template) untuk membentuk utas baru komplemennya. Sebagai contoh misalnya suatu utas ganda (double helix) DNA terurai pada pasangan basa A-T, maka salah satu utas berupa basa A dan utas lainnya adalah basa T. Selanjutnya selama proses replikasi, masing-masing utas bertindak sebagai cetakan dan membentuk utas pasangannya yang bersifat komplementer. Dengan kata lain utas cetakan A membentuk utas baru T, sebaliknya utas cetakan T membentuk utas baru A. Dengan demikian pada akhir proses replikasi akan diperoleh dua pasang A-T utas ganda DNA, dimana masing-masing pasangan terdiri dari utas cetakan yang berasal dari utas ganda lama dan utas baru komplemennya yang terbentuk selama proses replikasi. Secara singkat dapat dituliskan sbb. A lama- T baru dan A baru -T lama. Proses ini akan berlanjut untuk setiap pasangan basa di sepanjang double helik DNA. Mekanisme replikasi seperti ini dikenal dengan istilah replikasi semikonservatif. Hal ini didasarkan atas pertimbangan bahwa kedua double helix yang terbentuk di akhir replikasi tidak sepenuhnya baru, tetapi hanya salah satu utasnya yang baru. Disamping mekanisme semikonservatif dikenal dua mekanisme replikasi DNA lainnya yaitu konservatif dan dispersif. Pada mekanisme konservatif, suatu double helix akan bertindak sebagai cetakan sehingga dihasilkan double helix yang kedua utasnya baru. Dengan demikian pada akhir proses replikasi DNA akan diperoleh satu double helix lama yang berfungsi sebagai cetakan dan satu double helix baru yang terbentuk selama proses replikasi. Mengikuti model contoh pasangan basa A-T di atas maka akan diperoleh dua double helix sbb. : A lama- T lama dan A baru- T baru. Pada mekanisme replikasi dispersif, sebagian sekuen DNA digandakan sedang sebagian yang lain tidak, sehingga DNA anakan tersusun atas sebagian DNA template dan sebagian

DNA hasil replikasi. Pada kenyataannya, hipotesis ini sulit dicarikan data pendukungnya. Percobaan Meselson dan Stahl Pada tahun 1958 Meselson dan Stahl melaporkan hasil percobaannya untuk menentukan model replikasi DNA. Banyak sejarawan dan filosof ilmu pengetahuan menyebut-nyebut percobaan ini sebagai percobaan ilmiah yang paling elegan. Meselson dan Stahl menumbuhkan E. coil dalam medium yang mengandung isotop 15 N (bentuk normal adalah 14 N). Setelah tumbuh beberapa generasi dalam medium yang mengandung isotop 15 N, DNA E. coil semakin padat. Kepadatan DNA ditentukan dengan teknik sentrifugasi gradien kepadatan (density-gradient centrifugation). Pada teknik ini larutan Cecium kiorida (CsCI) dituangkan kedalam ultrasentrifuge pada kecepatan tinggi selama beberapa jam sampai terjadi kesetimbangan antara gaya sentrifugal dengan gaya difusi, dimana gradien kepadatan dibuat dalam tabung reaksitabung reaksi yang berbeda sebanding dengan peningkatan kepadatan CsCI dari atas ke dasar tabung reaksi. Jika DNA (atau substansi lain) ditambahkan maka akan terkonsentrasi dan membentuk pita (band) dalam tabung reaksi dimana kepadatannya sama dengan kepadatan CsCI. Jika DNA yang ditambahkan bermacam-macam kepadatannya, maka akan terbentuk beberapa pita. Pita selanjutnya dapat dideteksi dengan mengamati tabung di bawah penyinaran ultraviolet pada panjang gelombang 260 nm, dimana terjadi penyerapan cahaya ultraviolet paling kuat oleh asam nukleat. Meselson dan Stahl memindahkan DNA bakteri dari medium yang banyak mengandung 15 N kedalam medium yang hanya mengandung 14 N. DNA yang baru terbentuk dalam medium 14 N memiliki kepadatan DNA yang bervariasi dari jarang/rendah( 14 N) sampai padat ( 15 N). Hal ini yang dipakai dasar menyimpulkan bahwa replikasi DNA mengiktuti model semikonservatif. Kesimpulan ini diambil karena apabila replikasi DNA terjadi mengikuti model konservatif, maka seharusnya ada dua pita pada generasi pertama replikasi yaitu double helix baru ( 14 N) dan double helix lama ( 15 N). Dalam seluruh percobaan apabila replikasi DNA mengikuti model konservatif maka seharusnya DNA lama ( 15 N) selalu muncul sebagai satu pita, dan hal ini tidak pernah terjadi. Disisi lain apabila replikasi DNA mengikuti model dispersif maka seharusnya akan diperoleh pola pita yang sangat beragam (multiple band patterns), tergantung pada derajad dispersitasnya. Pada kenyataannya hasil percobaan selalu menunjukkan pola pita yang sejalan dengan model replikasi DNA semikonservatif, dan hanya pola itu yang selalu didapatkan. Dari percobaan ini

membuktikan bahwa replikasi DNA mengikuti model semikonservatif. Secara skematis ketiga model replikasi DNA digambarkan sbb.: 6.2. Enzim pengendali sintesis DNA Setelah membahas beberapa hipotesis model proses replikasi DNA, selanjutnya kita bahas proses replikasi DNA dalam perspektif sebagai proses metabolisme yang dikendalikan secara enzimatis. Sehubungan dengan hal tersebut akan dibahas tentang aspek fisis, kemis, dan biokemis enzim dan asam nukleat, dan analisis tentang mutasi yang terjadi yang mampu mempengaruhi jalannya proses replikasi DNA, khususnya pada E. coll. Ada tiga enzim polimerase yang mampu merangkai nukleotida menjadi sebuah utas ganda DNA pada E. coli. Ketiga enzim tersebut dikenal dengan nama enzim polimerase DNA I, II, dan III. Enzim polimerase DNA I ditemukan oleh Arthur Komberg yang kemudian mendapatkan hadiah nobel, yang utamanya berfungsi dalam pengisian segmen DNA yang kecil selama proses replikasi dan perbaikan DNA (repairing process). Polimerase DNA II dapat berperan sebagai altematif lain proses perbaikan, disamping mampu berperan sebagai polimerase DNA ketika templatenya mengalami kerusakan. Polimerase DNA III berperan dalam replikasi DNA selama kondisi normal. Pada model replikasi DNA yang paling sederhana, nukleotida baru yang terbentuk mengikuti aturan komplementasi, terjadi secara serentak untuk kedua utas template dalam membentuk utas baru pada Y-juction selama double strands dalam keadaan membuka. Persoalan muncul karena adanya aturan antiparalel suatu DNA, dimana kedua utas DNA bergerak dengan arah yang berlawanan selama proses replikasi. Sebagai contoh apabila salah satu utas bergerak dari ujung 5' 3', maka utas komplemennya akan bergerak dari ujung sebaliknya yaitu 3' 5'. Oleh karena replikasi DNA melibatkan dua double helix bare antiparalel dimana salah satu utas lamanya berfungsi sebagai template, maka salah satu utas baru akan digandakan/direplikasikan dengan arah 5' 3' dan utas komplemennya dengan arah 3'4 5'. Namun demikian, bukti-bukti ilmiah yang telah diketahui menunjukkan bahwa proses replikasi DNA hanya berjalan dari arah 5' 3'. Hal ini terjadi karena enzim polimerase hanya mampu mengkatalisis reaksi penggabungan 5'-PO 4 dengan 3'-PO 4 pada nukleotida bare yang terbentuk. Polimerase tidak mampu membentuk ikatan dengan 5'-PO 4 pada nukleotida yang telah ada di DNA dan ujung 3' dari nukleotida baru.

Dikenal dua macam replikasi DNA, yaitu kontinyu dan diskontinyu. Replikasi kontinyu terjadi pada template dengan arah 3' 5' yang akan dimulai dari primer 3'- OH. Replikasi diskontinyu terjadi pada utas komplemennya, dimana hanya berlangsung pada segmen yang pendek karena berjalan kebelakang menjauh dari Y- juction. Segmen-segmen yang pendek demikian disebut fragmen Okazaki karena ditemukan pertama kali oleh R. Okazaki yang melihat adanya segmen-segmen pendek sejumlah 1.500 nukleotida pada prokariot dan 150 pada eukariot. Utas yang mengalami replikasi kontinyu disebut leading strand, sebaliknya utas yang mengalami replikasi diskontinyu disebut lagging strand. Sekali suatu DNA memulai replikasi kontinyu, maka akan berlangsung terus. Enzim polimerase DNA Ill pada template leading strand memiliki suatu karakter yang disebut processivity, yang berarti sekali memulai reaksi tidak akan berhenti sampai semua leading strand digandakan. Sebaliknya pada replikasi diskontinyu selalu memerlukan pengulangan proses yang terdiri dari emapt tahap, yakni sintesis primer, pemanjangan, penghilangan primer, dan pemutusan. 6.3. Model molekuler replikasi DNA Inisiasi proses replikasi DNA pada E. coli terjadi pada sekuen spesifik yang disebut origin of replication atau biasa disingkat oric. Pada titik tersebut double helix mengalami denaturasi menjadi utas tunggal, dan memaparkan basa untuk memulai proses sintesis utas baru komplemennya. Sekuen ini akan menghasilkan apa yang disebut replication bubble yaitu daerah di dalam kromosom dimana DNA berada pada keadaan utas tunggal dan dari tiik tersebut proses replikasi dimulai yang berjalan dengan dua arah. DNA utas tunggal berfungsi sebagai utas template untuk pembentukan/sintesis utas baru komplemennya. Enzim primase DNA memiliki peran penting dalam proses replikasi DNA karena enzim polimerase DNA tidak mampu memulai sintesis DNA. Polimerase DNA hanya mampu menggandakan/menambah nukleotida tetapi tidak memiliki kemampuan untuk memulai proses. Primase mensintesis primer RNA (sekitar 11 nukleotida) yang kemudian akan ditambah nukleotida-nukleotida baru yang dibentuk oleh polimerase DNA, sehingga rantai DNA yang baru terbentuk. Selanjutnya primer RNA akan dihilangkan dan diganti dengan DNA. Perlu dibedakan pengertian antara template dan primer dalam kaitannya dengan proses replikasi DNA. Utas template adalah salah satu utas dari double helix DNA dimana tejadi sintesis utas baru mengikuti kaidah komplementasi pasangan basa. Sedangkan primer adalah suatu segmen pendek nukleotida yang terikat pada

utas template primer berfungsi sebagai substrat bagi enzim polimerase DNA, yang selanjutnya mengembangkan primer menjadi utas DNA baru yang bersifat komplementer dengan utas template. 6.4. Replikasi DNA eukariot Biokimia dan biologi molekuler proses replikasi DNA antara prokariot dan eukariot hampir sama. Namun demikian karena eukariot memiliki banyak kromosom di dalam genomnya, maka DNA tersebar di banyak kromosom sehingga lebih kompleks dibanding prokariot yang hanya memiliki satu kromosom dalam genomnya. Dalam setiap siklus sel, setiap kromosom terduplikasi secara sempuma yang kemudian diwariskan kepada sel anakan selama proses pembelahan. Hal ini berarti setiap DNA maupun protein histon mengalami penggandaan di setiap siklus sel. Proses replikasi DNA dan duplikasi kromosom berlangsung selama interfase/profase, sedangkan pemisahan kromosom ke sel anak terjadi selama metafase. Perkembangan tahap demi tahap dalam suatu siklus sel dikendalikan oleh aktivitas banyak gen dalam suatu sistem checks and balances. Begitu seuatu sel menyelesaikan fase G1 akan memacu proses replikasi DNA dan duplikasi kromosom pada fase S. Titik awal pada fase G1 biasa disebut START, menetukan apakah suatu sel harus melanjutkan ke fase berikutnya dalam siklus atau berhenti pada suatu fase sampai keadaan lingkungan memungkinkan untuk melanjutkan ke fase selanjutnya. Titik awal lainnya adalah titik awal G2 yang akan menentukan apakah suatu sel dapat memasuki fase mitosis dalam siklus hidupnya. Titik awal ketiga adalah pada fase metafase dimana kromosom harus melekat pada benang spindle untuk selanjutnya memisah ke kutub-kutub sel dan membentuk sel anakan. Telah diketahui bahwa enzim dan protein yang telibat didalam proses replikasi DNA pada prokariot terdapat juga pada eukariot, walaupun tahapan sintesis DNA pada prokariot tejadi juga pada eukariot, yaitu denaturasi DNA utas ganda dan replikasi semikonservatif, semidiskontinyu. Utas DNA baru dimulai dengan primer RNA dilanjutkan oleh polimerase DNA untuk memperpanjang rantai. Pada mamalia telah diidentifikasi 5 macam polimerase DNA, yaitu α (alpha), β ( beta), (delta), (gamma), dan (epsilon). Polimerase DNA α (alpha), β ( beta), (delta), dan (epsilon) berlokasi di nukleus, sedangkan polimerase DNA (gamma) berada di dalam mitokondria. Polimerase DNA α (alpha) dan (delta) merupakan enzim yang bertanggunjawab terhadap proses replikasi DNA di dalam kromosom. Polimerase

DNA β ( beta) berperan dalam proses reparasi DNA, dan polimerase DNA (epsilon) nampaknya memiliki fungsi serupa. Polimerase DNA (gamma) bertanggungjawab pada proses replikasi DNA mitokondria. Baik polimerase DNA α (alpha) dan (delta) yang berada di inti maupun polimerase DNA (gamma) yang brads di mitokondria menggunakan primer RNA sebagai inisiasi proses replikasi DNA. 6.5. Rekombinasi DNA Sejak pertengahan tahun 1960, Robin Holliday mengemukan suatu model rekombinasi DNA. Sejak saat itu model rekombinasi DNA diperbaharui oleh para ahli a.l. Matthew Meselson dan Charles Radding, dan T. Orr-Weaver dan Jack Szostak. Secara sederhana proses rekombinasi dapat digambarkan sebagai berikut. Misalkan untuk kromosom homolog alel-alelnya kita ben tanda a + dan b +, maka aleliknya adalah a dan b. Rekombinasi genetik akan terjadi diantara dua utas DNA. Ada beberapa tahap proses rekombinasi a.l. tahap pengenalan (recognition and alignment), dimana kedua double helix merapat dan berjajar sangat tepat, kemudian salah satu utas dari kedua pasang double helix putus. Utas yang putus kemudian menginvasi utas lain dari double helix homolognya mengikuti kaidah komplementer nukleotida. Enzim polimerase DNA dan ligase DNA bertanggungjawab terhadap proses ini, dimana pada akhir proses dihasilkan apa yang disebut Holliday intermediate. Hibrida molekul DNA ini (hasil rekombinasi) biasa dikenal dengan istilah heteroduplexes, yaitu utas ganda molekul DNA double helix yang tidak sepenuhnya komplementer. Fase selanjutnya adalah cleavage and ligation. Proses ini ditandai dengan pemotongan Holliday intermediate pada DNA utas tunggal di titik percabangan. Dengan demikian akan dihasilkan suatu utas tunggal yang mengandung segmen dari utas tunggal double helix homolognya. Mengikuti kodifikasi a + dan b + dengan aleliknya adalah a dan b, maka hasil rekombinasi dapat disimbolkan sebagai a + b dan a b +, dimana konfigurasi tetuanya adalah a + b + dan ab.

Gambar 5. Model replikasi DNA semikonservatif, konservatif dan dispersif