33 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini bersifat deskriftif dan eksperimental, dilakukan pengujian langsung efek hipoglikemik ekstrak kulit batang bungur terhadap glukosa darah mencit yang diinduksi aloksan dengan metode uji toleransi glukosa. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan meliputi: pengambilan dan pengolahan sampel, pembuatan ekstrak, skrining fitokimia, uji efek hipoglikemik, isolasi dan identifikasi senyawa tanin terkondensasi dan analisis data secara statistik dengan menggunakan metode ANOVA. 4.2 Bahan dan Alat 4.2.1 Bahan penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit batang bungur (Lagerstroemia speciosa Pers.) yang diambil di jalan Hangtuah sekitar bulan Desember 2010 dan telah dilakukan determinasi di UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Eka Karya Bali (Lampiran 4). Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit jantan Mus musculus strain Balb C yang berumur antara 2,5 3 bulan dengan bobot 21-30 g. 4.2.2 Bahan kimia Bahan kimia yang digunakan adalah Aquades, Etanol (teknis), Aseton (teknis), Asam klorida pekat (p.a.), Besi (III) klorida, serbuk Mg, n-heksana 33
34 (teknis), KLT silika gel GF 254, silika gel 60 Mesh, Aluminium klorida (p.a.), Kalium bromida (p.a.), aloksan monohidrat. 4.2.3 Alat Alat kimia yang digunakan adalah berupa alat-alat gelas yang biasa digunakan di Laboratorium kimia dan ditunjang dengan alat lainnya yaitu blender, timbangan, seperangkat alat uji hipoglikemik, seperangkat alat KLT, seperangkat alat kromatografi kolom, lampu UV, seperangkat alat IR dan seperangkat alat UV. 4.3 Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pengembangan Sumber Daya Genetik Kelautan dan Rekayasa Genetika Universitas Udayana. Uji efek hipoglikemik dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana Identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis dilakukan di Laboratorium Kesehatan Daerah Provinsi Bali dengan menggunakan alat UV- 1601 Shimadzu sedangkan identifikasi spektrofotometer inframerah dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada dengan menggunakan alat IR Prestige-21 Shimadzu.. 4.4 Metode Penelitian 4.4.1 Ekstraksi kulit batang bungur 4.4.1.1 Penyiapan bahan Kulit batang tumbuhan Bungur yang diperoleh dicuci sampai bersih dan dikeringkan dengan cara diletakkan ditempat terbuka dengan sirkulasi udara yang baik dan tidak terkena sinar matahari secara langsung, kemudian dihaluskan dengan blender.
35 4.4.1.2 Ekstraksi senyawa tanin Serbuk kulit batang bungur sebanyak ± 1500 g diekstraksi secara maserasi menggunakan pelarut etanol teknis 70% selama 24 jam, kemudian disaring. Ampas yang tersisa dimaserasi kembali dengan pelarut etanol berulang kali sampai volume total etanol 12 L. Ekstrak etanol yang diperoleh dipisahkan dari pelarutnya dengan menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu ± 40 ºC, sehingga diperoleh ekstrak etanol. 4.4.2 Uji Hipoglikemik 4.4.2.1 Penyiapan mencit diabetik Penelitian ini memakai binatang percobaan mencit jantan Mus musculus strain Balb C yang berumur antara 2,5-3 bulan, dengan berat badan antara 21-30 g sebanyak 24 ekor dengan empat jenis perlakuan dan enam kali ulangan. Aloksannya dilarutkan dengan aquabides 0,25 ml/20g bb mencit. Sebanyak 24 ekor mencit disuntik secara intraperitoneal dengan dosis 175 mg/kg (3.5 mg/20 gr bb mencit). Pada hari ke dua (2x24 jam) setelah penyuntikan kadar gula mencit diperiksa. Mencit dianggap sudah menderita diabetes jika kadar gula darahnya sudah mencapai 160 mg/dl. Jika belum mencapai 160 mg/dl, pemeriksaan dilakukan lagi pada hari ke tujuh. Jika belum juga tercapai, maka dianggap gagal dan mencit harus diganti dengan mencit lain. 4.4.2.2 Pengambilan darah mencit dan pemeriksaan glukosa darah Darah mencit diambil dari sinus orbitalis (pada sudut mata) dengan memakai microhaematocrit tube tepat mengenai medial canthus sinus oritalis (John, 1988). Kemudian darah dimasukkan ke glucose stick Easy Touch,
36 selanjutnya stick ini dimasukkan ke dalam alat glucosemeter Easy Touch. Hasil langsung dapat diamati. Perlakuan yang ada adalah sebagai berikut: 1. Dua puluh empat ekor mencit jantan diabet dibagi menjadi empat kelompok terdiri dari enam ekor (enam kali ulangan). Sebelum diberikan perlakuan, mencit dipuasakan selama 18 jam, selanjutnya diberi perlakuan sebagai berikut (seperti yang tertera pada Tabel 4.1): Tabel 4.1 Pengelompokan Perlakuan Terhadap Mencit Perlakuan Keterangan I Mencit diberikan 0,5 ml aquades (kontrol negatif) II mencit diberikan 0,5 ml ekstrak dengan dosis 150 mg/20 g bb mencit. III mencit diberikan 0,5 ml ekstrak dengan dosis 75 mg/20 g bb mencit. IV mencit diberikan 0,5 ml glibenklamid dengan dosis 3 mg/20 g bb mencit. 2. Tiga puluh menit kemudian mencit diberikan pembebanan glukosa monohidrat sebanyak 2 g/kg.bb. 3. Sempel darah diambil pada menit ke 60, 120, dan 180 setelah pemberian 4.4.3 Partisi glukosa monohidrat (Aman, 2007). Ekstrak etanol yang diperoleh dilarutkan dengan etanol:air (3:7). Kemudian pelarut etanolnya diuapkan dengan menggunakan rotary vacuum evaporator sehingga diperoleh ekstrak air. Ekstrak air yang diperoleh dipartisi dengan pelarut n-heksana dalam corong pisah, sehingga diperoleh ekstrak n- heksana dan ekstrak air. Ekstrak n-heksana dan ekstrak air yang diperoleh dikumpulkan.
37 Terhadap ekstrak air yang diperoleh dilakukan partisi menggunakan pelarut aseton hingga di dapat ekstrak aseton dan ekstrak air. Ekstrak n-heksana, ekstrak aseton dan ekstrak air kemudian dipekatkan menggunakan rotary vacuum evaporator. Ekstrak n-heksana, ekstrak aseton dan ekstrak air kemudian ditimbang dan diuji tanin. Ekstrak aseton tersebut selanjutnya dilakukan uji efek hipoglikemik, dipisahkan dan dimurnikan. 4.4.4 Pemisahan dan pemurnian Ekstrak yang positif mengandung tanin dipisahkan dengan cara teknik kromatografi. Sejumlah ekstrak dilarutkan didalam pelarut yang sesuai, selanjutnya dianalisis dengan kromatografi lapis tipis untuk memilih eluen yang akan digunakan dalam kromatografi kolom. Setelah diperoleh eluen yang sesuai, ekstrak yang positif tanin dipisahkan dengan kromatografi kolom menggunakan fasa diam silika gel 60. Tiap fraksi yang dihasilkan dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (silika gel GF 254 ), kemudian fraksi dengan pola noda yang sama digabungkan, diuapkan, ditimbang dan selanjutnya setiap fraksi diuji tanin. Fraksi yang positif tanin selanjutnya akan diuji kemurniannya. 4.4.4.1 Uji kemurnian Uji kemurnian dilakukan dengan kromatografi lapis tipis pada berbagai polaritas fase gerak. Jika isolat tetap menunjukkan noda tunggal pada kromatografi lapis tipis, analisis dilanjutkan dengan spektrofotometer UV dan IR.
38 4.4.5 Identifikasi senyawa tanin 4.4.5.1 Uji senyawa tanin Untuk memeriksa adanya senyawa tanin dalam bahan tumbuhan dilakukan dengan beberapa uji warna (Anwar, 1989; Robinson, 1995; Sirait, 1987): 1. Uji senyawa tanin menggunakan pereaksi FeCl 3. Adanya tanin pada sampel ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi hijau atau biru kehitaman. 2. Dengan menggunakan larutan gelatin. Sedikit sampel ditambahkan beberapa tetes larutan gelatin, reaksi positif bila terbentuk endapan. 3. Dengan menggunakan air brom. Sedikit sampel ditambahkan beberapa tetes air brom, reaksi positif bila terbentuk endapan. 4.4.5.2 Pengukuran spektrum UV-Vis Pengukuran spekrtum UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang 200-400 nm. Untuk mendapatkan spektrum UV-Vis, sejumlah isolat dilarutkan dalam pelarut metanol kemudian diamati serapannya. 4.4.5.3 Pengukuran spektrum inframerah Sedikit fraksi positif tanin yang relatif murni (isolat) digerus bersamasama kalium bromida (KBr) halus, kemudian dibuat dalam bentuk pelet. Selanjutnya diukur spektrumnya pada spektrofotometer inframerah.
39 4.4.6 Analisis data Data yang diperoleh pada uji efek hipoglikemik dianalisis dengan metode ANOVA (analysis of variant) pada SPSS 15.0 for Windows dengan menggunakan rancangan acak lengkap pada α = 0,05 untuk mengetahui perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol negatif, uji dosis 150 mg/20 g bb, uji 75 mg/20 g bb, dan kontrol positif. Data yang diperoleh dari keempat kelompok perlakuan mula-mula dilakukan uji normalitas menggunakan Kolmonogorov- Smirnov test dan uji homogenitas menggunakan Levene s test, kemudian dilanjutkan dengan uji ANOVA. Bila pada uji normalitas, p < 0,05 dan homogenitas, p < 0,05 maka dilakukan uji lanjutan dengan uji Kruskal Wallis, namun bila pada uji homogenitas, p > 0,05 maka dilakukan uji lanjutan dengan uji Tamhane.