26 Bab III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan dalam penelitian ini adalah penelitian eksperimen. Penelitian eksperimen adalah penelitian yang dilakukan dengan memberikan manipulasi terhadap objek penelitian dan adanya kontrol sebagai pembanding (Nazir, 1988). B. Desain Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga perlakuan yang berbeda-beda dan satu kontrol. dimana untuk setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak tujuh kali. Jumlah pengulangan yang ditetapkan pada tiap konsentrasi dan kontrol berdasarkan pada pengulangan RAL menurut Sugandi dan Sugiarto (1994) didasarkan atas nilai derajat bebas galat (>20) (Gomez & Gomez, 1995), dengan rumus adalah : t (r-1) 20 4(r-1) 20 4r 24 r 6 Dimana: t = Treatment r= Replication 26
27 Tabel Rancangan Acak Lengkap (RAL) dibuat secara random untuk menentukan jenis perlakuan dan pengulangannya. Tabel RAL yang digunakan pada penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 Desain Penelitian dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) A1 B1 D2 B2 A6 C4 A4 C1 A5 C4 D3 B5 D5 C2 B3 D4 D1 A2 B4 B4 B6 D3 C5 A7 B6 C1 D5 C3 C4 D6 B7 C6 D7 A3 C7 Keterangan: Tabel diatas menyatakan perlakuan dengan huruf dan pengulangan dengan angka. A. NaCl 0,85% (kontrol) B. Konsentrasi konidia 10 5 /ml C. Konsentrasi konidia 10 6 /ml D. Konsentrasi konidia 10 7 / ml C. Populasi dan Sampel 1. Populasi Populasi penelitian ini adalah seluruh B. germanica yang dibiakkan di Laboratorium PGSM Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.
28 2. Sampel Sampel yang digunakan penelitian adalah imago Blatella germanica jantan dan betina. Uji autodiseminasi jamur Beauveria bassiana terhadap Blatella germanica, masing-masing menggunakan sepasang kecoa dewasa jantan dan betina dengan tiga perlakuan konsentrasi spora yang berbeda (10 7, 10 6, 10 5 ) ditambah satu kontrol dimana masing-masing mengalami tujuh kali pengulangan. Jadi jumlah sampel Blatella germanica yang digunakan untuk uji ini adalah 1x4x7= 28 ekor B. germanica jantan, dan 1x4x7= 28 ekor B. germanica betina. Gambar 3.1. Tempat penyimpanan sampel D. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan di Laboratorium PGSM Jurusan Pendidikan Biologi Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia. Penelitian dimulai bulan Juli 2007 hingga Desember 2007.
29 E. ALAT DAN BAHAN Alat-alat yang digunakan dalam penelitian dapat dilihat pada tabel 3.2, sedangkan bahan yang digunakan dalam penelitian dapat dilihat pada Tabel 3.3. Tabel 3.2 Alat-alat yang Digunakan Dalam Penelitian No. Nama Alat Jumlah 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Autoclave merek EYELA model HL36AE Batang pengaduk Botol semprot Botol vial Cawan Petri merek Pyrex Corong kaca merek Pyrex Gelas kimia merek Pyrex Gelas ukur merek Pyrex Haemocytometer Improve Neubauer Hot plate & magnetic stirrer Jarum ose Kaca arloji merek Pyrex Kaca objek & kaca penutup Lux meter Mikroskop binokuler Mikroskop stereo Pembakar spirtus Pinset mikropipet Rak tabung dan papan miring Spatula Tabung reaksi merek Pyrex Thermohygrometer Transfer box Timbangan analitik merek AND Vorteks mixer merek EYELA 20 buah 10 buah 5 buah 3 buah 4 buah 5 buah 15 buah
30 Tabel 3.3 Bahan-bahan yang Digunakan Dalam Penelitian No. Nama Bahan Jumlah 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Alkohol 70% Aquades Benang Kain Kassa Kapas Lemak NaCl Natrium Benzoat Potato Dextrose Agar (PDA) Tissue Pelet Unggas 1000 ml 20 liter Secukupnya Secukupnya Secukupnya 4,25 gram 8,60 gram 19,50 gram Secukupnya 125 gram F. Serangga Uji Serangga uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Kecoa jerman (Blatella germanica) yang diperoleh dari Balai Penelitian Vektor dan Resevoir Penyakit (BPVRP) Salatiga, Jawa Tengah. Pemeliharaan dilakukan di Laboratorium Riset PGSM Jurusan Pendidikan Biologi UPI Bumi Siliwangi, Bandung. Kecoa jerman (Blatella germanica) dipelihara dalam tabung kaca dengan ukuran 50 x 30 x 30 cm 3, dengan penutup yang diberi kain kassa dan kawat sebagai ventilasi. Selama pemeliharaan Blatella germanica diberi makan pelet dan air. Sebagai tempat bertelur dan habitatnya digunakan potongan-potongan kayu yang bertingkat. Telur yang dihasilkan akan berkembang menjadi stadium dewasa.
31 Gambar 3.2 Kandang Blatella germanica G. Langkah Kerja 1. Studi Pendahuluan Pada tahap pendahuluan dilakukan perbanyakan isolat jamur Beauveria bassiana yang diperoleh dari Balai Proteksi Tanaman Perkebunan Jawa Barat di laboratorium Mikrobiologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI. Isolat jamur tersebut diinokulasikan pada tabung reaksi yang berisi medium PDA (Potatoes Dextrose Agar) steril kemudian simpan pada ruang inkubasi pada suhu kamar selama 14 hari. 2. Pembuatan Suspensi Spora Isolat Jamur Isolat murni jamur Beauveria bassiana yang diperoleh di dalam medium buatan PDA kemudian dibuat suspensi. Suspensi spora dibuat dengan cara memasukan 5 ml NaCl fisiologis 0,85% ke dalam kultur
32 murni isolat jamur entomopatogen yang terdapat pada medium PDA miring dalam tabung reaksi. Kemudian tabung reaksi dikocok dengan menggunakan vorteks selama satu menit hingga spora yang menempel pada permukaan medium terlepas. Suspensi spora kemudian dipindahkan ke tabung reaksi yang kosong dan steril, untuk menghindari penempelan kembali spora pada medium. Suspensi spora yang telah dipindahkan kemudian dihomogenkan kembali dengan menggunakan vorteks, lalu dilakukan penghitungan jumlah spora dengan menggunakan Haemocytometer Improved Nebauer. Sebanyak satu tetes spora yang diteteskan ke dalam Haemocytometer untuk dihitung jumlah sporanya dengan bantuan mikroskop dan handy counter. Menurut Kommedahl dan Burnes (1989) dalam Mulyati (2005), jumlah spora/ml dihitung berdasarkan rumus: Jumlah spora/ml = 50.000 x d (spora/ml) Keterangan : d = jumlah spora yang terhitung pada lima kotak kecil Haemocytometer
33 A D C B E Gambar 3.3 Daerah Penghitungan dalam Haemocytometer (Sumber : Cell counts using Improved Neubauer haemocytometer Prepared by Santiago Perez) Gambar 3.4. Sub kultur B. bassiana pada medium PDA agar miring (sumber : dokumentasi pribadi)
34 3. Uji Autodiseminasi Suspensi konidia yang diperoleh kemudian dituang ke dalam cawan petri, lalu B. germanica betina dicelupkan ke dalam cawan petri tersebut selama 30 detik. Pengujian dilakukan dengan pengulangan sebanyak tujuh kali ini diulang untuk masing-masing perlakuan. Pencelupan dilakukan selama tiga kali berturut-turut selama tiga hari untuk meningkatkan mortalitas dan mengantisipasi faktor lingkungan yang tak mendukung (Prayogo et al., 2005). Kemudian B. germanica betina virgin yang sudah terinfeksi dimasukkan ke dalam tabung vial yang telah diberi kapas dan pelet unggas. Selanjutnya B. germanica jantan virgin pun dimasukkan ke dalam botol vial tersebut agar terjadi perkawinan. Makanan dan kapas diganti setiap hari dan aqudes steril diteteskan setiap hari ke dalam kapas untuk menjaga kelembaban dan sebagai air minum. Pengamatan mortalitas, penggantian makanan, pengukuran faktor klimatik seperti temperatur, kelembaban dan intensitas cahaya dilakukan selama 28 hari H. Teknik Pengolahan Data Blatella. germanica jantan yang mati akibat terinfeksi dicatat untuk setiap perlakuan beserta pengulangannya selama 28 hari pengamatan. Analisis data menggunakan table kontingensi. Dalam daftar pada tabel kontigensi, tiap sel telah dibagi dua oleh garis diagonal. Bagian sel sebelah kiri atas
35 berisikan banyak data hasil pengamatan, jadi O ij, sedangkan bagian kanan bawah berisian banyak data teoritik atau diharapkan terjadi, yakni E ij. Nilai Frekuensi yang diharapkan (E ij ) dihitung E ij dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (Sudjana, 2005): E ij = (nio x noj) / n Dengan nio = jumlah baris ke i noj = jumlah kolom ke-j n = nio + noj Pasangan hipotesis yang akan diuji berdasarkan data seperti dalam daftar diatas adalah: Ho = kedua faktor bebas statistik H1 = kedua faktor tak bebas statistik Statistik yang digunakan untuk menguji hipotesis bahwa faktor mortalitas dan faktor perlakuan konsentrasi spora bersifat independen, digunakan rumus chi- kuadrat sebagai berikut (Sudjana, 2005): B x 2 = i= j K j= 1 ( O ij - E ij ) 2 /E ij Ho ditolak jika x 2 (1-α) {(B-1) (K-1)} dalam taraf nyata = α dan derajat kebebasan dk untuk distribusi chi-kuadrat = (B-1) (k-1). Besarnya hubungan faktor mortalitas dengan perlakuan dihitung dengan koefisien korelasi (Sudjana, 2005). Adapun rumus Koefisien Kontigensi adalah sebagai berikut: 2 x C= 2 N + x
36 Dimana : N = jumlah sampel Selanjutnya harga C yang diperoleh dibandingkan dengan koefisien kontigensi maksimum (Cmaks) untuk menilai derajat asosiasi antara faktor. Untuk menguji perbandingan tiap-tiap perlakuan dengan menggunakan tes Fisher. Adapun rumus yang digunakan adalah sebagai berikut (Siegel, 1992): p = (A+B)! (C+D)! (A+C)! (B+D) N!A!B!C!D
37 H. ALUR PENELITIAN. Tahap Persiapan Penyiapan alat& bahan yang akan digunakan Pembuatan medium PDA Pemeliharaan&pembiakan B.germanica Pembuatan kultur murni B. bassiana Pengamatan jamur B. bassiana Pembuatan suspensi konidia B.bassiana Uji Autodiseminasi Pengujian patogenitas jamur B. bassiana terhadap B. germanica jantan Reisolasi& pengamatan jamur yang tumbuh pada B. germanica Analisa Data