SELF-PROPAGATING ENTREPRENEURIAL EDUCATION DEVELOPMENT BIOINDUSTRI PENYIAPAN KULTUR STARTER Nimas Mayang Sabrina S, STP, MP Lab. Bioindustri, Jur Teknologi Industri Pertanian Universitas Brawijaya Email : nimas.sunyoto@ub.ac.id 1. PENDAHULUAN - Pengantar - Tujuan - Definisi 2. MIKROBA INDUSTRI 2.1 Kriteria Mikroba Industri 2.2 Seleksi 2.3 Fungsi Seleksi 3. PENYIAPAN KULTUR 3.1 Isolasi 3.2 Teknik Isolasi 3.3 Seleksi dan Identifikasi 3.4 Teknik Identifikasi 3.5 Pemeliharaan dan Pengawetan MODUL 6 Minggu 6 1. PENDAHULUAN 1.1 Pengantar Ada beberapa faktor yang mempengaruhi keberhasilan produksi barang dan jasa dengan menggunakan mikroorganisme diantaranya adalah mikroorganisme, kondisi lingkungan dan media atau kultur yang dipergunakan. Salah satu hal yang menentukan keberhasilan kultur adalah adanya penyiapan kultur yang baik. Untuk itu perlu dipelajari tentang penyiapan kultur dan mikroorganismenya. 1.2 Tujuan Penguasaan materi dalam modul ini, yang dirancang sebagai landasan dasar penyiapan kultur, akan dapat: Mengetahui dan mengenal penyiapan kultur starter Melakukan penyiapan kultur starter Membuktikan dan mengamati aspek penyiapan kultur starter
1.3 Definisi Merupakan kultur tertutup dimana medium segar berupa nutrien dengan jumlah tertentu diinokulasi dengan bakteri yang telah diketahui jumlahnya. Akhirnya nutrien habis dan terjadi akumulasi hasil akhir Mikroba akan mengalami dalam hal ukuran dan jumlah sampai periode tertentu akan menjadi dua kali lipat. Setelah nutrisi utama habis maka tidak akan mengalami pertambahan jumlah dan ukuran lagi, 2. MIKROBA INDUSTRI Sumber mikroba industri : sumber alami atau lembaga koleksi kultur - Sumber alami : tanah, air, sayuran segar/busuk, tanaman/hewan, - limbah dll jumlah dan jenis mikroba sangat beragam Tahap pertama dalam seleksi mikroba yang akan digunakan untuk industri adalah isolasi mikroba, sehingga diperoleh kultur murni (sifat morfologi & fisiologi seragam). Setelah itu dilakukan seleksi sehingga diperoleh galur dengan kinerja terbaik. Terakhir baru dilakukan identifikasi dengan menggunakan kunci-kunci yang sesuai, sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba tersebut Mikroba yang telah diperoleh sepatutnya disimpan dengan baik dengan teknik penyimpanan yang baik, sehingga kemurniannya terpelihara dalam jangka waktu yang panjang. 2.1 Kriteria Mikroba Industri : Merupakan galur murni Sifat genetiknya stabil Dapat menghasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit reproduktif lain Mampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasi Mampu menghasilkan produk yang diinginkan dalam waktu yang pendek & tidak menghasilkan produk sampingan yang toksik Mampu melindungi diri dari kontaminasi (ph, suhu, inhibitor) Dapat disimpan dalam jangka waktu yang panjang Galur dapat dikembangkan kualitasnya (mutasi), sehingga produksinya meningkat 2.2 Untuk melakukan seleksi harus memperhatikan : Sensitivitas Tidak mahal cara spesifik (kecil kesalahan positip dan negatipnya) Dapat digunakan untuk memprediksi hasilnya nanti Sederhana Dapat ditingkatkan ke cara lebih modern (otomatisasi) Page 2 of 9
2.3 Fungsi Seleksi Harus dihasilkan produk baru yang kompetitif, bermutu tinggi, harga bersaing, tanpa meninggalkan konsep lingkungan Konsumsi produk menggunakan mikroorganisme dan enzim untuk pangan dan obat-obatan menanjak dengan cepat Tantangan peningkatan kapasitas produk Penelitian dasar dan pengembangannya harus dilakukan Rekayasa pengolahan harus dilakukan 3. PENYIAPAN KULTUR 3.1 Isolasi Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari campuran biakan mikroba di alam sel individu terpisah Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam dan media apa yang akan digunakan Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas) Teknik Isolasi Kultur Murni : - Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate) - Penuangan (Pour-plate) - Kultur yang Diperkaya - Pengenceran Berseri (Serial-dilution) - Isolasi Sel Tunggal 3.2 Teknik Isolasi a. Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran (Spread-plate) - Untuk bakteri paling sesuai - Menggunakan agar cawan - Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri & menggunakan peralatan yang sederhana. Page 3 of 9
- Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat digunakan/disebarkan pada media - Dua sel dapat bergabung manjadi membentuk satu koloni, contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak pencegahan dengan menambahkan deterjen b. Teknik Penuangan (Pour-plate) - Metode Penuangan Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif (morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba) - Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawan Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora contoh terlebih dulu dipanaskan s.d 85 0 C 5 menit - Media Selektif : Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari faeces Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : Salmonellae - Media Diferensial : Media agar EMB (eosin-methylene blue agar) terbentuk koloni berbeda & mudah dikenali E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda Page 4 of 9
c. Teknik Kultur yang Diperkaya - Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat) - Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu - Cara: d. Teknik Pengenceran Berseri (Serial dilution) - Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba lain. Contoh : S. lactis dalam susu asam - Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya mengandung 1 galur mikroba - Perlu dicek kemurnian kultur e. Tenik Isolasi Sel Tunggal - Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari preparat tetes bergantung - Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media yang sesuai - Lebih cepat, namun kelemahannya : alat mahal & operator harus trampil 3.3 Seleksi dan Identifikasi Seleksi bertujuan untuk mendapatkan galur dengan kinerja terbaik dan rendemen tinggi, tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak dikehendaki, meningkatkan kemampuan penggunaan sumber karbon dan nitrogen yang murah, dan menjadikan morfologi sel menjadi bentuk yang lebih mudah dipisahkan dari produk. Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba : - Mutasi - Rekombinasi Identifikasi: Penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan Page 5 of 9
nomenklatur untuk mengidentifikasi mikroba dengan membandingkan dengan ciri-ciri/ karakteristik yang ada. Menggunakan kunci-kunci yang sesuai Contoh : Bakteri : Bergey s Manual of Determinative Bacteriology Menggunakan kombinasi biner Latin, misalnya Rhizopus oryzae 3.4 Teknik Identifikasi Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan ciri/karakteristik : a. Morfologis, Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak. b. Nutrisional, Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba c. Kultural, Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media,baik cair maupun padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna dll) d. Metabolik, Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba ( kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas dll) Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan i. Salmonella typhi tidak dapat e. Susunan Kimiawi, Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, nukleus, membran dll) f. Susunan antigen, Penelaahan sifat antigen antibodi yang khas Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi Page 6 of 9
antibodi saat diinjeksikan ke hewan g. Patogenik, Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit h. Genetik, Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe 3.5 Pemeliharaan dan Pengawetan Tujuan : Cara : Pohon Filogenetik untuk Identifikasi Genomik - menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya perubahan genetik & tidak terkontaminasi harus mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba selama diawetkan a. Pemindahan Secara Periodik - Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar - Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus tepat tetap mempertahankan kultur awal b. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral - Permukaan agar miring dilapisi dengan minyak mineral steril (+/- 0,5 inci) - Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah minyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segar dengan tetap mempertahankan kultur awal Page 7 of 9
c. Liofilisasi - Pengeringan beku (freeze-drying) - Merupakan cara paling efektif untuk mengawetkan kultur bakteri (dapat tetap hidup & tidak berubah lebih dari 20 th) - Cara: media berisi senyawa pelindung : susu, serum, natrium glutamat dll suspensi mikroba ditempatkan dalam ampul (vial) Perendalam dalam es kering + alkohol (-78 0 C) beku Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum kering Ampul ditutup di bawah vakum - Keuntungan: Tahan lama Kemungkinan perubahan kecil Wadah penyimpanan kecil d. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah - Menggunakan nitrogen cair (sekitar -176 0 C) - Sel dibekukan dengan diberi pelindung (gliserol atau dimetil sulfoksida) Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair - Cocok untuk kapang - Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini e. Penyimpanan pada Tanah Steril - Diterapkan untuk penyimpanan spora REFERENSI Kohler, G.A. 1996. Bioindustry. California Researh Bureau. Sacramento. Mangunwidjaja, D. dan Suryani, A. 1994. Teknologi Bioproses. Penebar Swadaya Petrides. D.P, Calandranis, N.J. and Conney, C.L. 2006. Dalam Brock, T.d et al, Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2 nd ed. ASM Press, Washington, D.C. PROPAGASI A. Latihan dan Diskusi (Propagasi vertical dan Horizontal) 1. Jelaskan perbedaan antara streak dan spread plate? 2. Jelaskan mengenai teknik pengenceran berseri (Serial dilution)! Page 8 of 9
B. Pertanyaan (Evaluasi mandiri) 1. Apakah yang dimaksud dengan kultur batch? 2. Apa saja yang harus diperhatikan dalam penyiapan kultur? 3. Apa yang dimaksud dengan liofilisasi? 4. Apa yang dimaksud dengan pohon filogenetik? 5. Apa yang dimaksud dengan isolasi kultur? C. QUIZ -mutiple choice (Evaluasi) 1. Beri contoh-contoh produksi produk-produk bioteknologi menjadi bioindustri yang saudara ketahui ( boleh di dalam dan di luar negeri)! 2. Uraikan alasan saudara bahwa bahan baku merupakan salah satu faktor penting juga juga dalam bioindustri! 3. Apabila di negara berkembang ( termasuk Indonesia ) bahan baku siap pakai untuk bioindustri arganya mahal, bagaimana akal saudara untuk mengganti bahan baku tersebut supaya kegiatan bioindustri tetap dapat berjalan? 4. Bagaimana mekanisme fermentasi wine dengan menggunakan khamir? 5. Bagaimana kapang dapat berperan pada industri asam sitrat? Jelaskan secara lengkap mekanismenya! D. PROYEK (Eksplorasi entrepreneurship, penerapan topic bahasan pada dunia nyata) Review Jurnal isolasi/identifikasi/mutasi dan presentasikan! Page 9 of 9