III. METODOLOGI PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Zoologi Biologi FMIPA Universitas Lampung untuk pemeliharaan dan pemberian perlakuan pada mencit dan pembuatan preparat histologis testis dilaksanakan di Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional III. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan April 2013 sampai dengan Mei 2013. B. Alat dan Bahan 1. Hewan Percobaan Penelitian ini menggunakan mencit (Mus musculus L.) jantan yang berasal dari BPPV Regional III Bandar Lampung sebanyak 25 ekor. Mencit yang digunakan dalam penelitian ini memiliki berat rata-rata sekitar 30-35 gram berumur ± 3 bulan.
32 Sebelum diberi perlakuan, mencit diaklimatisasi terlebih dahulu selama kurang lebih 1 minggu. Aklimatisasi ini dilakukan dengan tujuan agar mencit terbiasa dengan tempat tinggal yang baru dan tidak stress. 2. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang mencit yang berbentuk persegi berukuran 15x15 cm dengan penutup kawat sebanyak 20 kandang. Sumber kebisingan berasal dari software soundcard scope. SLM (Sound Level Meter) digunakan untuk mengukur intensitas bunyi dan steroform digunakan sebagai alat peredam suara. Alat lainnya yang digunakan adalah gelas kimia, timbangan mencit, kotak mencit, papan fiksasi, botol minum mencit, kaca penutup (cover glass), stopwatch, mikroskop cahaya dan seperangkat alat untuk pembuatan preparat histologis testis. 3. Bahan Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu organ testis mencit, Aluminium foil, xylol, parafin, aquades, alkohol 80%, alkohol 95%, alkohol 96%, alkohol absolut, eosin, pewarna harris, larutan PBS (Phosphat Buffer Saline) dengan ph 6,8 dan kloroform.
33 C. Pelaksanaan Penelitian 1. Pemberian perlakuan Paparan yang diberikan sebagai perlakuan terhadap mencit adalah sebagai berikut: 1. Kebisingan yang diberikan sebagai perlakuan terhadap mencit bersumber dari software soundcard scope yang diberi tambahan pengeras suara dengan intensitas kebisingan 85-90 dba. 2. Mencit ditempatkan pada ruangan yang diberi paparan suara kebisingan dengan jarak 1 meter dari tempat mencit berada. 3. 25 ekor mencit jantan dewasa dibagi mejadi 5 kelompok dengan masingmasing kelompok tersebut terdiri dari 5 ekor mencit jantan dewasa. Berikut adalah uraian dari masing-masing kelompok : a. Kelompok kontrol (K) : kelompok kontrol ini tidak diberi perlakuan karena sebagai pembanding yang normal terhadap kelompok mencit yang diberi perlakuan paparan kebisingan. b. Kelompok paparan I (P1): kelompok ini diberi paparan kebisingan 85-90 db dengan intensitas paparan sebesar 6 jam per hari selama 21 hari. c. Kelompok paparan II (P2): kelompok ini diberi paparan kebisingan 85-90 db dengan intensitas paparan sebesar 8 jam per hari selama 21 hari.
34 d. Kelompok paparan III (P3): kelompok ini diberi paparan kebisingan 85-90 db dengan intensitas paparan sebesar 10 jam per hari selama 21 hari. e. Kelompok paparan IV (P4): kelompok ini diberi paparan kebisingan 85-90 db dengan intensitas paparan sebesar 12 jam per hari selama 21 hari. (Keputusan Menteri Tenaga Kerja No.51 tentang Nilai Ambang Batas Kebisingan,1999). 2. Sketsa penelitian Sketsa penelitian disusun dengan merangkaikan 4 alat yaitu laptop yang telah terhubung dengan sound applications (soundcard scope). Soundcard scope ini berfungsi sebagai sumber suara yang kemudian dihubungkan dengan pengeras suara (speaker). Suara yang dikeluarkan dari speaker akan diukur menggunakan alat SLM (Sound Level Meter) dengan intensitas kebisingan sebesar 85-90 dba. Speaker inilah yang akan secara langsung memberikan paparan kebisingan terhadap mencit yang berada di bawahnya. Jumlah kandang mencit yang digunakan ada 4 yaitu kandang mencit dengan label pemaparan kebisingan selama 6 jam/hari, 8 jam/hari, 10 jam/hari, dan 12 jam/hari. Gambar desain penelitian dapat dilihat pada Gambar 5.
35 Gambar 5. Sketsa penelitian paparan kebisingan 3. Proses Pembedahan Mencit (Mus musculus L.) Setelah mencit diberi perlakuan selama 21 hari, maka pada hari yang ke-22 dilakukan pembedahan untuk mengambil organ testis dari mencit tersebut. Sebelum dibedah, mencit dibius dengan kloroform, selanjutnya mencit dibedah mulai di bagian ventral tubuh secara vertikal, lalu diambil testisnya. Testis yang telah diambil segera ditimbang dengan timbangan analitik dan difiksasi menggunakan larutan formalin 10% di dalam botol. Perbandingan volume spesimen dengan larutan formalin 1:10 untuk mendapatkan hasil yang sempurna.
36 Kemudian organ testis tersebut dibawa ke laboratorium Patologi, Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional III Bandar Lampung, untuk seterusnya dibuat preparat histologisnya. 4. Pembuatan Preparat Histologis Testis Mencit (Mus musculus L.) Pembuatan preparat histologis testis mencit ini dilakukan di Laboratorium Patologi, Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional III. Adapun cara pembuatan preparat histologis testis adalah sebagai berikut : a. Trimming Trimming adalah suatu proses tahapan yang dilakukan setelah proses fiksasi, dimana buffer formalin 10% dihilangkan menggunakan air mengalir selama 30 menit. Berikut ini adalah proses tahapan trimming : 1. Spesimen berupa potongan organ atau jaringan tubuh yang telah dipilih segera difiksasi dengan larutan pengawet berupa buffer formalin atau 10% formalin. 2. Organ tersebut dicuci dengan air mengalir. 3. Jaringan dipotong setebal 2-4 mm. 4. Potongan-potongan jaringan dimasukkan ke dalam embedding casette. Dalam satu embedding casette dapat diisi 1-5 buah potongan jaringan yang disesuaikan dengan ukuran besar kecilnya potongan. 5. Potongan jaringan tersebut dicuci dengan air mengalir.
37 b. Dehidrasi Dehidrasi adalah proses penarikan molekul air dari dalam jaringan. Tujuan dari dehidrasi adalah agar seluruh ruang-ruang antar sel dalam jaringan dapat diisi dengan molekul parafin. Berikut ini adalah proses tahapan dehidrasi : 1. Air dituntaskan dengan meletakkan embedding casette pada kertas tisu. 2. Berturut-turut dilakukan perlakuan sebagai berikut : Tabel 3. Tahapan proses dehidrasi Tahap Waktu Zat kimia 2 jam Alkohol 80 % 2 jam Alkohol 95 % Dehidration 1 jam Alkohol 95 % 1 jam Alkohol absolut I 1 jam Alkohol absolut II 1 jam Alkohol absolut III 1 jam Xylol I Clearing 1 jam Xylol II 1 jam Xylol III 2 jam Paraffin I Impregnasi 2 jam Paraffin II 2 jam Paraffin III
38 c. Embedding Adapun proses tahapan embedding adalah sebagai berikut : 1. Sisa-sisa parafin pada pan dibersihkan dengan memanaskan beberapa saat di atas api kemudian diusap dengan kapas. 2. Parafin cair dimasukkan ke dalam cangkir logam dan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu di atas 58 o C. 3. Parafin cair dituangkan ke dalam pan. 4. Jaringan dipindahkan satu persatu dari embedding casette ke dasar pan dengan mengatur jarak satu dengan lainnya. 5. Pan dimasukkan ke dalam air. 6. Parafin yang berisi jaringan tersebut dilepaskan dari pan dengan memasukkan ke dalam oven dengan suhu 4-6 o C beberapa saat. 7. Parafin dipotong sesuai dengan letak jaringan yang ada menggunakan skalpel atau pisau hangat. 8. Potongan parafin diletakkan pada balok kayu, pinggirnya diratakan dan ujungnya dibuat sedikit meruncing. 9. Blok parafin siap dipotong dengan mikrotom. d. Cutting Cutting adalah proses pemotongan atau pengirisan jaringan dengan menggunakan mikrotom yang dilakukan di ruangan dingin.
39 Berikut ini adalah proses tahapan cutting : 1. Sebelum jaringan dipotong, blok terlebih dahulu didinginkan. 2. Dilakukan pemotongan kasar dan dilanjutkan dengan pemotongan halus dengan ketebalan 4-5 mikron. 3. Setelah pemotongan dipilih lembaran jaringan yang paling baik, diapungkan pada air dan dihilangkan kerutannya dengan cara menekan salah satu sisi lembaran jaringan tersebut dengan ujung jarum dan sisi yang lain ditarik dengan menggunakan kuas runcing. 4. Lembaran jaringan tersebut dipindahkan ke dalam water bath selama beberapa detik sampai mengembang sempurna. 5. Dengan gerakan menyendok, lembaran jaringan diambil dengan slide bersih dan ditempatkan di tengah atau atau pada sepertiga atas atau bawah, dicegah jangan sampai ada gelembung udara di bawah jaringan. 6. Slide yang berisi jaringan ditempatkan pada inkubator (suhu 37 o C) selama 24 jam sampai jaringan melekat sempurna. e. Stainning Setelah jaringan melekat sempurna, dilakukan pewarnaan dengan menggunakan pewarna Hematoxylin Eosin (HE). Slide yang dipilih adalah yang terbaik, selanjutnya secara berurutan dimasukkan ke dalam zat kimia sebagaimana tersaji pada Tabel 4.
40 Tabel 4. Tahapan proses stainning Zat kimia Xylol I Xylol II Xylol III Alkohol absolut I Alkohol absolut II Aquadest Harris Hematoxylin Aquadest Acid Alkohol Aquadest Aquadest Eosin Alkohol 96 % I Alkohol 96 % II Alkohol absolut III Alkohol absolut IV Xylol IV Xylol V Waktu 1 menit 20 menit 1 menit 2-3 celupan 1 menit 1 2 menit 2 menit 3 menit 3 menit 3 menit
41 Zat kimia yang digunakan dalam pewarnaan ini adalah sebagai berikut: 1. Hematoxylin Kristal : 5 g 2. Alkohol absolute : 50 ml 3. Ammonium : 100g/L 4. Aquadest : 1000 ml 5. Mercury oxide : 2,5 g f. Mounting Setelah pewarnaan slide selesai, slide ditempelkan di atas kertas tisu pada tempat yang datar, selanjutnya ditetesi Canada Balsam dan ditutup dengan cover glass. Hal yang harus dihindari adalah jangan sampai terbentuk gelembung udara. g. Pengamatan/Pembacaan slide Preparat yang telah jadi, diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali, 200 kali, dan 400 kali. Kemudian diamati perubahan yang terjadi.
42 D. Parameter yang Diamati Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Berat testis 2. Derajat kerusakan struktur histologis testis mencit. E. Rancangan Penelitian dan Analisis Data Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terbagi atas 5 kelompok perlakuan. Masing-masing perlakuan dan kontrol memiliki ulangan 5 ekor mencit. Data berat organ testis yang diperoleh akan diolah secara kuantitatif. Data dianalisis dengan Analisis Ragam (ANARA) untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan perlakuan. Apabila ada perbedaan yang nyata maka akan dilakukan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) pada taraf 5 % untuk perbandingan dari masing-masing kelompok. Hasil pemeriksaan struktur histologis sel-sel tubulus seminiferus akan dianalisa secara deskriptif.
43 F. Diagram Alir Penelitian 25 mencit jantan diaklimatisasi selama 7 hari (1 minggu) Mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan masing-masing 5 ekor mencit (P0) tidak diberikan paparan (P1) diberi paparan 6 jam/hari dengan intensitas bising 85-90 db (P2) diberi paparan 8 jam/hari dengan intensitas bising 85-90 db (P3) diberi paparan 10 jam/hari dengan intensitas bising 85-90 db (P4) diberi paparan 12 jam/hari dengan intensitas bising 85-90 db Nekropsi organ testis Pembuatan preparat organ testis Pengamatan slide preparat organ testis Skripsi/ laporan Gambar 6. Diagram Alir Penelitian