3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus sampai dengan bulan Desember 2009 di Laboratorium Teknologi Pengolahan Pangan Hasil Pertanian, Departemen Teknik Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian; Laboratorium Nutrisi Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Laboratorium Karakteristik dan Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah fillet ikan patin yang berukuran satu kilogram/ekor yang berasal dari Ciherang-Bogor. Bahan pembantu lainnya adalah es, air, gas CO 2, N 2 ; plastik Polipropilen (PP) dengan ukuran 15x30 cm dan ketebalan 0,8 mm untuk pengemasan fillet. Bahan-bahan pereaksi yang digunakan untuk uji-uji yang dilakukan, untuk uji protein digunakan kjeltab, H 2 SO 4, asam borat, HCl, untuk uji ph digunakan buffer ph 4 dan 7, untuk uji TVBN digunakan TCA 7%, asam borat, K 2 CO 3, HCl, untuk uji TPC digunakan NaCl 0,85%, plate count agar (PCA), untuk uji TBA digunakan HCl 4 M, pereaksi TBA, akuades. Alat yang digunakan adalah mixer gas, Cosmotector tipe X-314, flow meter, alat vakum udara dan coolbox. Untuk analisis proksimat digunakan kjeltec system, oven, tanur, ekstraksi soxhlet, timbangan analitik, lalu untuk TVB digunakan gelas piala, stirrer, magnetic stirrer, gelas ukur, erlenmeyer, cawan Conway; gunting, pisau, timbangan analitik, pipet 1 ml, blender jars, Erlenmeyer ukuran 250 ml, batang pengaduk, tabung reaksi, inkubator, pinset, cawan petri, Bunsen untuk TPC; ph-meter untuk uji nilai ph, refrigerator dengan suhu 5 0 C untuk penyimpanan, score sheet untuk melakukan uji organoleptik.
3.3. Metode Penelitian Ikan patin yang diperoleh dari pasar ditransportasikan ke laboratorium lalu dicuci dan dibersihkan dengan air mengalir. Setelah dibersihkan, ikan dipotong kepalanya dan dikeluarkan isi perutnya yang bertujuan juga untuk mengeluarkan darah dari daging ikan. Kemudian ikan patin difillet dari bagian pangkal ekor hingga pangkal kepala. Selama pemfilletan ikan diberi pecahan es untuk menjaga kesegaran ikan. Selanjutnya ikan dimasukkan ke dalam cool box yang telah disediakan es dan dibawa ke laboratorium pengemasan. Sebelum pengemasan fillet ikan dianalisis proksimat terlebih dahulu. Setelah berada di laboratorium pengemasan, fillet ikan patin dimasukkan ke dalam plastik PP lalu diseal dengan memberikan ruang untuk memasukkan gas melalui selang. Kemudian, gas dimasukkan ke dalam kemasan-kemasan ikan patin dengan komposisi yang berbeda-beda melalui selang, yaitu kemasan dengan perlakuan 40% CO 2 +60% N 2 (A1), 60% CO 2 +40% N 2 (A2), 80% CO 2 +20% N 2 (A3), kemasan vakum (A4), dan udara biasa sebagai kontrol (A5). Kemasan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam lemari pendingin untuk penyimpanan suhu 5 0 C dan penyimpanan suhu ruang. Pengamatan untuk suhu 5 0 C dilakukan selama 16 hari yaitu pada hari ke 0, 4, 8, 12 dan 16 sedangkan pengamatan untuk suhu ruang dilakukan selama 2 hari yaitu pada jam ke 0, 5, 10, 15 dan 20. Uji pada fillet ikan meliputi Total Volatile Base-Nitrogen (TVBN), jumlah mikroba (TPC), nilai ph, uji TBA (untuk fillet pada penyimpanan suhu 5 0 C) dan uji organoleptik yang dibandingkan dengan kontrol. Diagram alir prosedur penelitian disajikan pada Gambar 2 di bawah ini. Ikan Patin Analisis Penyiangan (Pemotongan kepala + Pembersihan perut) Pemfilletan A
A Pengemasan dalam plastik polipropilen (PP) Kemasan divakum menggunakan pompa vakum Pemasukan gas dengan perlakuan komposisi : A1 : 40% CO 2 + 60% N 2 A2 : 60% CO 2 + 40% N 2 A3 : 80% CO 2 + 20% N 2 A4: Vakum A5 : Kontrol/udara biasa Penyimpanan Suhu ruang Suhu 5 o C Pengamatan pada jam ke-0, 5, 10, 15, 20 Pengamatan pada hari ke-0, 4, 8, 12, 16 Analisis TVB, TPC, ph, dan organoleptik Analisis TVB, TPC, TBA, ph, dan organoleptik Gambar 2. Diagram alir prosedur metode penelitian
3.4. Metode 3.4.1 Analisis proksimat Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat meliputi analisis kadar air, abu, protein, dan lemak. 1. Analisis kadar air (AOAC 1995) Prinsip dari analisis kadar air yaitu untuk mengetahui kandungan atau jumlah kadar air yang terdapat pada suatu bahan. Tahap pertama yang dilakukan pada analisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 o C selama 10-15 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 30 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan, kemudian cawan dan daging ikan patin seberat 5 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dipotong kecil-kecil. Selanjutnya cawan tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 o C selama 3-5 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air pada fillet ikan patin adalah: Keterangan : % Kadar air = A = Berat cawan kosong (gram) B C B A 100% B = Berat cawan dengan daging ikan patin (gram) C = Berat cawan dengan daging ikan patin setelah dikeringkan (gram) 2. Analisis kadar abu (AOAC 1995) Prinsip dari analisis kadar abu yaitu untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dari bahan yang dianalisis. Cawan abu porselen dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 650 o C selama 1 jam. Cawan abu porselen tersebut didinginkan selama 30 menit setelah suhu tungku turun menjadi sekitar 200 o C dan ditimbang. Fillet ikan patin sebanyak 1-2 gram yang telah dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam cawan
abu porselen. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam tungku secara bertahap hingga suhu 650 o C. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah suhu tungku pengabuan turun menjadi sekitar 200 o C, cawan abu porselin didinginkan selama 30 menit dan kemudian ditimbang beratnya. Perhitungan kadar abu pada fillet ikan patin: Keterangan : % Kadar abu = C A B A 100% A = Berat cawan abu porselen kosong (gram) B = Berat cawan abu porselen dengan fillet ikan patin (gram) C = Berat cawan abu porselen dengan fillet ikan patin setelah dikeringkan (gram) 3. Analisis kadar protein (AOAC 1995) Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar (crude protein) pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. (1) Tahap destruksi Fillet ikan patin ditimbang seberat 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 o C ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. (2) Tahap destilasi Destilasi terdiri dari 2 tahap, yaitu persiapan dan sampel. Tahap persiapan dilakukan dengan membuka kran air kemudian dilakukan pengecekan alkali dan air dalam tanki, tabung dan erlenmeyer yang berisi akuades diletakkan pada tempatnya. Tombol power pada kjeltec sistem ditekan lalu dilanjutkan dengan menekan tombol steam dan tungku beberapa lama sampai air di dalam tabung mendidih. Steam dimatikan, tabung kjeltec dan erlenmeyer dikeluarkan dari alat kjeltec sistem. Tahap sampel dilakukan dengan meletakkan tabung yang berisi fillet ikan patin yang sudah didestruksi ke dalam kjeltec sistem beserta erlenmeyer yang
diberi asam borat. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer yang berisi asam borat mencapai 200 ml. (3) Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada erlenmeyer berubah warna menjadi pink. Perhitungan kadar protein pada fillet ikan patin: % Nitrogen = ml HCl fillet ikan patin ml HCl blanko 0,1 N HCl 14 100% fillet ikan patin % Kadar protein = % Nitrogen faktor konversi 4. Analisis kadar lemak (AOAC 1995) Fillet ikan patin seberat 3 gram (W 1 ) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W 2 ) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 o C dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W 3 ). Perhitungan kadar lemak pada fillet ikan patin: Keterangan : % Kadar lemak = W 3 W 2 W 1 W 1 = Berat sampel fillet ikan patin (gram) W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W 3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 100%
3.4.2 Nilai ph (Sudarmadji et al. 1984) Penetapan nilai ph dapat dilakukan setelah ph meter dikalibrasi terlebih dahulu. Setelah sampel disiapkan, suhu diukur kemudian pengatur suhu ph meter ditetapkan pada suhu tersebut. Stabilisasi ph-meter dilakukan 15-30 menit. Setelah itu, elektroda dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Elektroda dicelupkan ke dalam larutan sampel dengan pengukuran ph diset. Elektroda dibiarkan tercelup beberapa saat sampai diperoleh pembacaan yang stabil, kemudian ph sampel data dicatat. 3.4.3 Total Volatile Bases Nitrogen (TVBN) (AOAC 1995) Prinsip penetapan TVBN adalah menguapkan senyawa-senyawa basa volatil (amoniak, mono-, di- dan trimetilamin, dll) yang terdapat dalam ekstrak ikan yang bersifat basa pada suhu 35 o C selama 2 jam atau pada suhu kamar selama semalam. Senyawa-senyawa tersebut diikat oleh asam borat kemudian dititrasi dengan HCl. Prosedur kerjanya yaitu 25 gr sampel ikan yang sudah digiling dan 75 ml larutan TCA 7% (b/v) dilumat selama 1 menit. Larutan tadi disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh filtrat yang jernih. Larutan asam borat sebanyak 1 ml dituangkan ke dalam inner chamber cawan Conway. Filtrat dimasukkan ke dalam outer chamber sebanyak 1 ml dari arah yang berlawanan sehingga ke dua macam larutan belum tercampur. Tutup cawan diletakkan di atas cawan dengan posisi hampir menutup, kemudian 1 ml K 2 CO 3 jenuh dituangkan ke dalam outer chamber. Setelah itu, cawan langsung ditutup dengan rapat. Sebelumnya, bibir cawan maupun tutup cawan diolesin dengan vaselin. Pada cawan blanko, filtrat sampel diganti dengan larutan 5% TCA dan dikerjakan seperti prosedur di atas. Untuk setiap sampel dan blanko dikerjakan secara duplo. Cawan Conway disusun pada rak inkubator secara hati-hati, kemudian digoyangkan perlahan-lahan selama 1 menit. Selanjutnya diinkubasikan selama 2 jam pada suhu 35 o C atau disimpan dalam suhu kamar selama semalam.
Larutan asam borat dalam inner chamber dititrasi dengan HCl menggunakan magnetic stirrer sehingga larutan asam borat berubah menjadi merah muda. TVBN (mgn/100g) = (ml titrasi sampel ml titrasi blanko ) 100 g daging ikan x 80 mg N 3.4.4 Total Plate Count (TPC) (Fardiaz 1987) Prinsip dari pengamatan ini adalah menentukan besarnya populasi bakteri yang terdapat pada ikan, yang memberikan gambaran tentang bagaimana tingkat kesegaran ikan tersebut, karena bakteri merupakan faktor utama penyebab pembusukan yang sedang berlangsung. Prosedur kerjanya terdiri dari empat tahap yang saling berhubungan yaitu tahap persiapan, penanaman, pengeraman dan perhitungan. Pertama, 5 gr daging ikan ditimbang secara aseptis dan representatif, dimasukkan ke dalam blender jars steril dan ditambahkan pada 90 ml NaCl 0,85% steril, kemudian diblender selama beberapa detik dengan kecepatan rendah dan dilanjutkan dengan kecepatan tinggi selama 2 menit. Larutan yang didapat adalah pengenceran 1:10. Selanjutnya dipipet larutan 1:10 diatas sebanyak 1 ml, dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan 1 ml lagi sebagai duplo. Kemudian disiapkan larutan contoh 1:100, dengan memipet 1 ml larutan 1:10 dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan NaCl 0,85 % steril, lalu dikocok sampai homogen. Larutan contoh 1:100 ini dimasukkan ke dalam cawan petri steril kedua dan secara duplo. Selanjutnya dengan cara yang sama dikerjakan inokulasi contoh sampai dengan pengenceran 1:1.000.000 yang dilakukan secara aseptis. Ke dalam semua cawan petri yang telah berisi larutan contoh di atas, dituangkan secara aseptis media tumbuh plate count agar (PCA) steril bersuhu 45 o C sebanyak 15 ml, dan dibiarkan selama 15-20 menit sampai agarnya memadat. Setelah itu, semua cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu 30 o C dengan posisi terbalik selama 48 jam dengan posisi terbalik. Disamping itu dibuat blanko, yaitu ke dalam cawan petri steril hanya dituangkan media tumbuh PCA 15 ml. Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah bakteri dengan menggunakan alat hitung Quebec. Perhitungan dilakukan disesuaikan dengan Standard Plate Count (SPC).
3.4.5 Analisis bilangan Thiobarbituric Acid (TBA) metode Tarladgis (Apriyantono et al. 1989) Sampel ditimbang sebanyak 10 gram dengan teliti, dimasukkan ke dalam wearing blender. Ditambahkan 50 ml akuades dan dihancurkan. Sampel yang telah dihancurkan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu destilasi sambil dicuci dengan 47,5 ml akuades. Selanjutnya ditambahkan ± 2,5 ml HCl 4 M (atau hingga ph menjadi 1,5) sampel didestilasi dengan menggunakan pendingin tegak (alat destilasi) hingga diperoleh cairan destilat sebanyak 50 ml ± 10 menit pemanasan. Destilat yang diperoleh diaduk hingga homogen dan dipipet ke dalam tabung reaksi tertutup sebanyak 5 ml. Pereaksi TBA ditambahkan 5 ml, kemudian divorteks hingga homogen. Larutan sampel dipanaskan dalam air mendidih selama 35 menit kemudian didinginkan dengan air mengalir selama 10 menit. Larutan blanko dibuat dengan menggunakan 5 ml akuades dan 5 ml pereaksi dengan cara yang sama seperti penetapan sampel. Larutan blanko ditetapkan sebagai titik nol dalam pengukuran absorbansi. Larutan sampel kemudian diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 528 nm. Bilangan TBA didefenisikan sebagai mg malnodehid per kg. Perhitungan bilangan TBA dalam sampel dilakukan melalui persamaan: Bilangan TBA (mg malonaldehid/kg) = 3 bobot sampel nilai absorbansi 7,8 3.4.6 Uji Organoleptik (Soekarto 1985) Untuk melakukan kondisi optimal penyimpanan fillet ikan dalam kemasan atmosfer termodifikasi dilakukan uji organoleptik dengan 10 skala mutu hedonik (Soekarto 1985). Pengujian dilakukan terhadap penampakan, bau, warna, tekstur berdasarkan pada kesukaan panelis. Panelis tetap yang dilibatkan adalah 10 orang. Kriteria penilaian dikonversikan ke dalam angka-angka. 3.5. Analisis Data (Steel & Torrie 1991) Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian adalah rancangan acak lengkap dengan percobaan dua faktor dan dua kali ulangan. Faktor yang pertama adalah komposisi gas yang dimasukkan ke dalam kemasan plastik fillet ikan, terdiri dari 5 taraf, yaitu 40%CO 2 + 60% N 2 (A1); 60% CO 2 + 40% N 2 (A2);
80% CO 2 + 20% N 2 (A3); vakum (A4), dan udara biasa (sebagai kontrol) (A5). Faktor yang kedua adalah masa simpan yang terdiri dari masa simpan untuk suhu 5 0 C yaitu hari ke-0 (B1), 4 (B2), 8 (B3), 12 (B4), 16 (B5) dan untuk suhu ruang yaitu jam ke-0 (B1), 5 (B2), 10 (B3), 15 (B4), 20 (B5). Setelah diketahui bahwa perlakuan memberikan pengaruh terhadap hasil TPC, TVB,TBA dan ph, maka dilakukan uji Lanjut Duncan. Model rancangan acak lengkap atau RAL, dengan percobaan dua faktor adalah sebagai berikut: Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + Σ ijk Y ijk = faktor pengamatan pada faktor ke-a taraf ke-i, faktor ke- B taraf ke-j dan ulangan ke-k. (µ, α i, β j ) = komponen additif dari rataan, pengaruh utama faktor A taraf kei dan pengaruh utama faktor B taraf ke-j. (αβ) ij = komponen interaksi dari faktor A taraf ke-i dan faktor B taraf ke-j. Σijk = pengaruh acak yang menyebar normal (0, σ 2 ). i = 1,2,3,4,5 j = 1,2,3,4,5 Data hasil pengamatan diolah dengan analisis ragam (Analysis of Variance). Bila hasil dari analisis ragam memperlihatkan pengaruh nyata atau sangat nyata, maka dilakukan uji lanjut dengan Duncan s Multiple Test Range (DMRT), sehingga diketahui perlakuan yang memberikan hasil berbeda dengan perlakuan yang lain. Data hasil uji organoleptik diolah menggunakan Metode Kruskal Wallis. Uji Kruskal Wallis dilakukan pada warna, penampakan, bau dan tekstur. Apabila memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap uji organoleptik maka akan diolah lebih lanjut menggunakan Uji Multiple Comparison.
Uji Kruskal Wallis H = 12 n(n + 1) H = Pembagi = 1 i R i n i H Pembagi 3(n + 1) t n 1 (n + 1) Keterangan : n n i R i t = jumlah data = banyaknya pengamatan dalam perlakuan ke-i = jumlah rangking dalam perlakuan ke-i = banyaknya pengamatan yang seri dalam kelompok H = H terkoreksi Uji Multiple Comparison R i R j >< Z /2p n + 1 k 6 Keterangan : R i R j n k = rata-rata rangking perlakuan ke-i = rata-rata perlakuan ke-j = jumlah total data = banyaknya ulangan