BAB II METODE PENELITIAN 2.1. Teknik Pengumpulan Data 2.1.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan (Mikologi). Analisis tanah dilaksanakan di Laboratorium Ilmu Tanah Fakultas Pertanian Universitas Udayana. Penelitian ini dilaksanakan selama empat bulan (Oktober 2012 Januari 2013). 2.1.2 Teknik Pengambilan Sampel Pengambilan sampel tanah dilakukan pada dua lokasi yang berbeda di Dusun Sendang, Desa Pemuteran, Kecamatan Gerokgak, Kabupaten Buleleng dan di Desa Sukadana, Kecamatan Kubu, Kabupaten Karangasem luas areal perkebunan masing-masing lokasi adalah 2 Ha. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada bulan Juni, Agustus, dan Oktober 2011. Pengambilan sampel dilakukan dengan metode jelajah/eksplorasi yaitu menentukan titik-titik pengambilan sampel (secara acak dengan cara membuat pengundian yang ditentukan pada lima titik pengambilan sampel), untuk menghubungkan titik satu dengan titik yang lainnya diberikan jarak ± 200 meter. Sampel tanah diambil pada rizosfer/area di sekeliling akar tanaman mete dengan kedalaman 10-20 cm dengan menggunakan skop. Sampel tanah dari lima tanaman mete dicampur (komposit) dan diambil ± 100 gram, kemudian tiap-tiap titik 6
pengambilan sampel yang lainya (sampai titik ke lima) dilakukan dengan cara yang sama (Proborini, kompri). Adapun peta lokasi, foto perkebunan, dan daerah/sketsa pengambilan sampel tanah pada perkebunan jambu mete di Dusun Sendang, Desa Pemuteran, Kecamatan Gerokgak, Kabupaten Buleleng dan Desa Sukadana, Kecamatan Kubu, Kabupaten Karangasem, seperti tercantum pada Gambar : 12, 13, 14, 15, 16, 17 dan 18 yang tertera pada Lampiran (Lampiran 9). 2.2 Cara Kerja 2.2.1. Persiapan Disiapkan alat dan bahan untuk disterilisasi (cawan petri yang telah dibungkus, media Potato Dextrose Agar (PDA) dan media Malt Extrac Agar (MEA) yang telah dibuat, mikropipet, jarum ose, tabung reaksi dan botol yang telah diisi air steril sesuai takaran) pada autoclave selama 15 menit dengan tekanan 15 lbs dengan temperatur 121 0 C (Proborini, 2002). 2.2.2. Pembuatan Media PDA Pembuatan 1 litter media Potato Dextrose Agar (PDA), dilakukan dengan cara kentang yang telah dikupas kulitnya dan dipotong-potong sebanyak 200 gram kemudian dimasukan ke dalam 800 ml aquades, direbus sampai mendidih, kemudian diambil ekstraknya. Disiapkan agar agar sebanyak 15 gram dan dextrose 10 gram dilarutkan dalam 200 ml aquades. Kemudian air ekstrak kentang dicampur dengan agar dan dextrose yang telah dilarutkan, kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga homogen, jika air berkurang bisa ditambahkan lagi air 7
sehingga campuran media menjadi 1000 ml kemudian disterilisasi dalam autoclave selama 15 menit dengan tekanan 15 lbs dan pada temperatur 121 0 C (Proborini, 2002). 2.2.3. Pembuatan Media MEA Pembuatan 1 litter media Malt Extrac Agar (MEA), dilakukan dengan cara media MEA (dengan komposisi Maltose Certfied, Dextrin, Glycerol, Pepton, Bacteriological Agar) ditimbang sebanyak 33 gram kemudian dituang kedalam erlemeyer glass dan tambahkan 1000 ml aquades, panaskan diatas penangas (dengan temperature 100 0 C) aduk hingga rata, setelah itu tunggu ± 10 menit atau hingga mendidih dan disterilisasi dalam autoclave selama 15 menit dengan tekanan 15 lbs dan pada temperatur 121 0 C (Proborini, 2002). 2.3. Pelaksanaan 2.3.1. Isolasi Cendawan dan Perhitungan Total Koloni Cendawan Isolasi cendawan dilakukan dengan metode pour plate (Pelczar dan Chan, 2006). Isolasi cendawan tanah dilakukan pada pengenceran 10-3. Pada pengenceran 10-1 botol yang telah terisi air steril sebanyak 90 ml ditambah sampel tanah sebanyak 10 gram kemudian dikocok hingga homogen, pengenceran 10-2 tabung reaksi yang telah terisi air steril sebanyak 9 ml kemudian ditambahkan 1 ml suspensi sampel tanah dari pengenceran sebelumnya kemudian di vortex langkah ini dilakukan sampai pengenceran 10-5 dari pengenceran tersebut masingmasing dituang dalam cawan petri steril, kemudian media PDA dituang ke dalam petri pada suhu 40 0 C dan cawan petri diputar hingga homogen, selanjutnya 8
dilakukan inkubasi selama 2 3 hari. Hifa yang tumbuh kemudian diamati dan dipindahkan ke media baru (reisolasi), selanjutnya diidentifikasi, pada penelitian ini dilakukannya tiga kali ulangan (Proborini, 2002) Total koloni cendawan yang tumbuh pada media PDA, akan tampak warna awal yaitu berwarna putih, kemudian diamati, dipilih yang dianggap memiliki ciri-ciri sperti cendawan. Dihitung total koloni dengan menggunakan rumus. Rumus yang digunakan untuk menghitung total koloni cendawan yaitu: Jumlah cendawan = Jumlah koloni per cawan x 1 Faktor_Pengenceran Dengan satuan CFU (Colony Forming Units) (Kawuri dkk, 2007). 2.3.2 Penyebaran Jenis Cendawan Untuk mengetahui penyebaran jenis-jenis cendawan di rizosfer perkebunan jambu mete pada kedua lokasi (Sukadana Karangasem dan Sendang Buleleng) dapat digunakan seperti rumus pola penyebaran yang ada dibawah ini : Rumus : V M Keterangan : V = Varian ( X) X2 2 N N 1 = X M = Mean/rata-rata individu N = Jumlah spesies X = Jumlah individu masing-masing spesies (Odum, 1993) 2.3.3. Pembuatan Biakan Murni (Reisolasi) Pembuatan biakan murni dilakukan dengan cara mengambil hifa atau spora cendawan pada sampel yang telah terisolasi dengan menggunakan jarum ose dan dibiakkan pada cawan petri steril yang telah diisi media MEA. Pada 9
pembuatan biakan murni dilakukan di dekat api bunsen untuk meminimalisir kontaminasi yang mungkin terjadi ( Proborini, 2002 ). 2.3.4. Identifikasi Identifikasi cendawan dilakukan dengan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis. Secara makroskopis parameter yang diamati adalah warna permukaan koloni cendawan, warna sebalik koloni cendawan, ada atau tidaknya garis radial atau konsentris, mengeluarkan eksudat atau tidak, pigmentasi cendawan terhadap media, diamati permukaan koloninya dan cara pertumbuhan cendawan (cepat atau lambat pada media) (Proborini, 2002). Identifikasi mikroskopis dilakukan dengan cara hifa atau spora cendawan diambil dengan menggunakan jarum ose, diletakkan pada gelas benda yang telah diberi laktophenol atau laktophenol blue dan tutup dengan gelas penutup, kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop serta hasil yang diperoleh, dicocokkan dengan buku kunci identifikasi cendawan. Literatur yang digunakan untuk mengidentifikasi cendawan adalah Pengenalan kapang tropik umum. Gandjar, dkk., 1999.; Fungi and Food Spoilage. Pitt and Hocking. 1997; dan Pengantar Mikologi. Darnetty. 2006. 2.3.5. Analisis Tanah Untuk mengetahui secara lengkap yang mendukung kehidupan cendawan, maka dilakukan analisis tanah yang telah diujikan oleh petugas Laboratorium di Laboratorium Ilmu Tanah Fakultas Pertanian Universitas Udayana. Parameter yang dianalisis secara lengkap yaitu ph tanah, DHL/Daya Hantar Listrik, 10
Kandungan C-Organik, Kandungan N-Total, P-Tersedia, K-Tersedia, KTK, KB, Kadar Air, dan Tekstur Tanah. Analisis tanah dilakukan dengan menggunakan beberapa metode. Untuk ph tanah dilakukan dengan metode Elektrode glass, untuk DHL menggunakan metode Kehantaran Listrik, uji C-Organik menggunakan metode Walkley & Black, uji N-Total menggunakan metode Kjeldhall, uji P-Tersedia dan K-Tersedia menggunakan metode Bray-1, uji KTK dan KB menggunakan metode Pengekstrak NH4Oac, dan untuk uji tekstur tanah menggunakan metode pipet (Reeuwijk, 1993). Kelengkapan data penelitian ini dilakukan analisis tanah yang telah diujikan oleh petugas Laboratorium, untuk melihat apakah hasil analisis tersebut dapat mempengaruhi keberadaan, keanekaragaman, dan distribusi cendawan tersebut pada kedua lokasi. Untuk data tanah (hasil analisis di Laboratorium) dilakukan analisis data yaitu dengan mengetahui kriteria penilaian dari masingmasing parameter yang diujikan seperti tertera pada (Lampiran 1), untuk analisis ph yang diujikan tertera pada (Lampiran 1), dan untuk penetapan tekstur tanah ditentukan dengan menggunakan diagram segitiga tekstur (USDA) seperti yang tertera pada Lampiran 8. 2.4. Teknik Pengolahan Data 2.4.1. Analisis Data Data yang diperoleh dalam penelitian dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif yaitu dengan cara mendeskripsikan jenis-jenis cendawan yang ditemukan pada kedua lokasi (Desa Gerokgak dan Kubu), sedangkan secara kuantitatif yaitu dengan menghitung total koloni cendawan 11
kedua lokasi yang berbeda tersebut dengan rumus yang telah ditetapkan (Lampiran 3). Untuk menghitung total jenis dan jumlah cendawan pada kedua lokasi yang berbeda ditentukan dengan rumus pola penyebaran (Lampiran 5). 12