MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Non Ruminansia dan Satwa Harapan, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor untuk uji fisik dan di Balai Besar Industri Agro (BBIA) Bogor dan Laboratorium Kimia Bersama Institut Pertanian Bogor untuk uji kimia. Penelitian ini berlangsung selama 3 bulan dimulai dari tanggal 1 Februari 2012 sampai dengan 30 April 2012. Materi Sampel yang digunakan adalah 40 merek madu komersial yang beredar di kota Bogor yang terdiri dari 20 madu dari toko/supermarket dan 20 madu dari pasar tradisional dengan merek yang berbeda dan bahan yang digunakan sebagai kontrol (pembanding) adalah madu murni yang diambil langsung dari peternakan lebah di Bogor. Bahan yang digunakan untuk uji fisik adalah sampel madu komersial, air hangat, ikan mentah, bawang merah dan potongan daging sapi. Alat yang digunakan untuk uji fisik adalah sendok teh, sendok makan, sendok ukur, piring plastik berwarna putih, korek api, lilin, gelas kaca, gelas ukur, lidi, termometer, botol selai, gelas plastik, plastik bening, stopwatch dan kamera. Bahan yang digunakan untuk uji kimia adalah madu komersial murni, air, aquades, tisu, larutan ferosianida dan seng asetat, NaHSO 3 0,2%, dan acetonitril. Alat yang digunakan untuk uji kimia adalah ph-meter digital SCHOTT, refraktometer, labu ukur 50 ml, kertas saring abu, spektrofotometer, instrument High Performance Liquid Cromatografi (HPLC), dan syringe gelas. Prosedur Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap yakni (1) penyiapan madu kontrol dan sampel, (2) penyempurnaan metode uji kemurnian yang dilakukan oleh Rachmawaty (2011) dan dilanjutkan dengan uji kemurnian menggunakan metode oleh Rachmawaty (2011) yang telah disempurnakan, dan (3) analisis kimia madu dari peternakan lebah dan pasar Bogor (analisis kimia dilakukan terhadap madu
murni dengan persentase keberhasilan tiap uji diatas 50%), uji tambahan (uji aroma, rasa, warna, semut, rembesan, dan gesek), dan analisis data. Penyiapan Madu Kontrol dan Sampel Madu sampel yang digunakan didapatkan dari dua tempat, yaitu dari pasar tradisional sebanyak 20 sampel dan dari toko/supermarket sebanyak 20 sampel dengan merek yang berbeda. Apabila terdapat sampel dengan merek yang sama di pasar tradisional dan toko/supermarket, maka sampel digolongkan pada sampel dari toko/supermarket. Cara pengambilan sampel dilakukan secara acak, tanpa memperhatikan warna, sumber nektar, maupun wadah. Madu yang ditemukan kemudian dijadikan sampel. Pemilihan 40 sampel didasarkan pada jumlah merek madu yang didapatkan. Volume madu yang diambil berkisar 300-500 ml. Madu sampel yang didapatkan kemudian diberi kode dengan penomoran 1-40. Penyempurnaan Metode Uji Kemurnian Madu Uji kemurnian yang telah dilakukan Rachmawaty (2011) masih perlu disempurnakan karena belum mencantumkan kuantifikasi (standarisasi) pada setiap metode sehingga belum dapat dijadikan standar dalam pengujian kemurnian madu. Penyempurnaan yang dilakukan adalah mengestimasi atau mengkuantifikasi metode uji tersebut secara trial and error (1) Penyempurnaan metode pada uji larut yaitu pada faktor kemiringan dengan sudut 30 0, suhu 50 0, dan menggunakan gelas jus. (2) Penyempurnaan metode uji buih dan keruh yaitu pada faktor kecepatan sebanyak 100 adukan selama 30 detik, menggunakan pengaduk sendok teh, dan konsitensi buih lebih dari 10 menit (3) Penyempurnaan metode uji pemanasan yaitu pada faktor tipe sendok menggunakan sendok makan, volume madu sebanyak 5 ml, dan waktu pemanasan kurang dari 2 menit (4) Penyempurnaan metode uji segienam yaitu pada faktor pengulangan gerakan angka 8 sebanyak 3 kali, konsistensi segienam selama 10 detik, dan bentuk segienam yang jelas dan beraturan. Uji Kemurnian. Uji kemurnian dilakukan terlebih dahulu pada madu murni yang diambil langsung dari peternakan lebah sebagai kontrol (pembanding). Madu kontrol yang digunakan didapatkan langsung dari peternakan lebah di Bantarjati, Bogor dan kemudian dilakukan penyempurnaan dengan mengkuantifikasi setiap metode uji kemurnian. Setelah itu dilakukan uji kemurnian pada 40 sampel madu komersial. 16
Setiap sampel madu diuji secara fisik yaitu uji larut, uji pemanasan, uji keruh, uji buih, uji segienam, uji ikan mentah, uji bawang dan uji daging. Masing- masing uji dilakukan sebanyak lima kali ulangan. Uji Larut (Rachmawaty, 2011, disempurnakan). Madu sebanyak 10 ml dalam sendok makan dituangkan perlahan-lahan ke dalam gelas dengan tinggi 15 cm yang berisi 200 ml air dengan tinggi 10 cm dan bersuhu 50 o C dengan jarak vertikal 10 cm dari permukaan air dan dengan kemiringan sebesar 30 o. Tempat pengujian diberi alas berupa kain putih agar terlihat jelas pergerakan madu ketika dituang. Jika segera terjadi pencampuran antara madu dan air maka diberi nilai 0 (madu tidak murni) dan jika tidak terjadi pencampuran antara madu dan air diberi nilai 1 (madu murni) dan dicatat waktu terjadinya pencampuran sempurna. Cara uji larut dapat dilihat pada Gambar 1 (A), nilai 1 (madu murni) pada Gambar 1 (B) dan nilai 0 (madu tidak murni) pada Gambar 1 (C). (A) (B) (C) Gambar 1. Metode Uji Larut (A), Respon Madu Murni (B), dan Respon Madu Tidak Murni (C) Uji Keruh & Buih. (Rachmawaty, 2011, disempurnakan). Madu sebanyak 10 ml dicampur dengan 200 ml air dalam gelas kaca bening, kemudian diaduk dengan sendok teh kira-kira sebanyak 100 kali selama 30 detik hingga tercampur secara merata. Jika timbul buih namun cepat hilang dan madu yang tercampur bening diberi nilai 0 (madu tidak murni) dan jika timbul buih dan tidak cepat hilang dan madu yang tercampur keruh diberi nilai 1 (madu murni) dan dicatat waktu menghilangnya buih. Cara uji buih dapat dilihat pada Gambar 2 (A) untuk madu 17
murni dan Gambar 2 (B) untuk madu tidak murni. Cara uji keruh dapat dilihat pada Gambar 3 (A) untuk madu murni dan Gambar 3 (B) untuk madu tidak murni. (A) (B) Gambar 2. Respon Uji Buih Madu Murni (A) dan Madu Tidak Murni (B) (A) (B) Gambar 3. Respon Uji Keruh Madu Murni (A) dan Madu Tidak Murni (B) Uji Pemanasan (Rachmawaty, 2011, disempurnakan). Sebanyak 5 ml madu dalam sendok makan yang baru dibakar selama 2 menit di atas lilin dengan panjang sumbu 1 cm dengan jarak 2 cm dari permukaan api. Jika madu tidak segera meluber (tidak tumpah dari sendok) maka diberi nilai 0 (madu tidak murni), dan jika terbentuk busa dan busa meluber (tumpah dari sendok) maka diberi nilai 1 (madu murni) dan dicatat waktu terbentuknya busa. Cara uji pemanasan dapat dilihat pada Gambar 4 (A) untuk madu murni dan Gambar 4 (B) utuk madu tidak murni. 18
(A) (B) Gambar 4. Respon Uji Pemanasan Madu Murni (A) dan Madu Tidak Murni (B) Uji Segi Enam (Rachmawaty, 2011, disempurnakan). Madu sebanyak 10 ml dituangkan ke dalam piring putih berdiameter 15 cm kemudian ditambahkan air sebanyak 200 ml melalui pinggiran piring hingga madu tenggelam. Piring digerakkan perlahan membentuk angka delapan sebanyak tiga kali. Jika segienam yang terbentuk tidak jelas, cepat hilang dan tidak beraturan maka beri nilai 0 (madu tidak murni) dan jika segienam yang terbentuk jelas, tidak cepat hilang dan beraturan diberi nilai 1 (madu murni), dan dicatat waktu mulai terbentuknya dan menghilangnya segi enam. Cara uji segienam dapat dilihat pada Gambar 5 (A) untuk madu murni dan Gambar 5 (B) untuk madu tidak murni. (A) (B) Gambar 5. Respon Uji Segienam Madu Murni (A) dan Madu Tidak Murni (B) 19
Uji Ikan Mentah (Rachmawaty, 2011, disempurnakan). Ikan air tawar baby fish (mujair) mentah dengan panjang 5 cm yang masih utuh dan segar dimasukkan ke dalam gelas plastik ukuran 250 ml, kemudian dimasukkan madu sebanyak 50 ml pada masing-masing gelas, diberi lidi sebagai penyangga agar ikan tetap stabil di dasar gelas. Tutup gelas dengan plastik, ikat dengan karet dan diamkan selama dua minggu di tempat yang sejuk dan tidak terkena panas matahari. Setelah 2 minggu ikan diamati. Jika ikan bertekstur basah serta tidak menyusut dan madu tidak mencair (tidak menyerap air) maka diberi nilai 0 (madu tidak murni) dan jika ikan bertekstur kering, tidak berbau dan madu mencair (menyerap air) diberi nilai 1 (madu murni). Cara uji ikan mentah dapat dilihat pada Gambar 6. Gambar 6. Uji Ikan mentah Uji Bawang. Bawang merah utuh tanpa kulit dengan panjang 3 cm yang masih segar dimasukkan ke dalam gelas plastik ukuran 250 ml, kemudian dimasukkan madu sebanyak 50 ml pada masing-masing gelas, diberi lidi sebagai penyangga agar bawang tetap stabil di dasar gelas. Tutup gelas dengan plastik, ikat dengan karet dan diamkan selama dua minggu di tempat yang sejuk dan tidak terkena panas matahari. Jika bawang utuh dan tidak busuk maka diberi nilai 0 (madu tidak murni) dan jika bawang menyusut dan berubah warna menjadi ungu kehitaman diberi nilai 1 (madu murni). Cara uji bawang dapat dilihat pada Gambar 7. 20
Gambar 7. Uji Bawang Uji Daging. Potongan daging sapi ukuran kecil 2x2 cm yang masih segar dimasukkan ke gelas plastik ukuran 250 ml, kemudian dimasukkan madu sebanyak 50 ml pada masing-masing gelas, diberi lidi sebagai penyangga agar daging tetap stabil di dasar gelas. Tutup gelas dengan plastik, ikat dengan karet dan diamkan selama dua minggu di tempat yang sejuk dan tidak terkena panas matahari. Setelah 2 minggu daging diamati. Jika daging berwarna kehitaman diberi nilai 0 (madu tidak murni) dan jika daging berwarna kemerahan diberi nilai 1 (madu murni). Cara uji daging dapat dilihat pada Gambar 8. Gambar 8. Uji Daging Analisis Kimia Analisis kimia yang dilakukan adalah pengukuran kadar air, uji HMF dan uji kadar gula. Analisis kimia dilakukan terhadap madu sampel dengan persentase keberhasilan tiap uji di atas 50%. Sampel diuji di laboratorium BBIA Bogor dan 21
Laboratorium Kimia Bersama, Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Kadar Air (Standar Nasional Indonesia 01-3545-2004). Kadar air diukur dengan alat refraktometer ATAGO (berskala 42% - 72%). Sampel madu diteteskan ke dalam refraktometer dan kemudian kadar air dibaca dengan cara meneropong refraktometer. Refraktometer dibersihkan dengan akuades dan tisu setelah digunakan. Pengukuran kadar air dilakukan sebanyak lima kali ulangan. Kadar Hidroksimetilfurfural (HMF) (Standar Nasional Indonesia 01-3545- 2004). Kadar HMF diukur dengan alat Spektrofotometer HP 8453. Spektrofotometer yang biasa dipakai harus mempunyai panjang gelombang 284 nm dan 336 nm, mempunyai sel 1 cm. Tahap pertama Larutan carez I (15 g ferosianida K 4 Fe(CN) 6. 3H 2 O dilarutkan dengan air dan diencerkan sampai 100 ml) dan larutan carez II (30 g seng asetat Zn(CH 3 COO) 2. 2H 2 O dilarutkan dengan air dan diencerkan sampai 100 ml) dipersiapkan. Sebanyak lima gram sampel madu ditimbang dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditambahkan akuades sampai larutan dalam labu ukur mencapai kurang lebih 25 ml. Sebanyak 0,5 ml larutan carez I ditambahkan ke dalam labu ukur kemudian diaduk. Tahap selanjutnya larutan carez II ditambahkan ke dalam labu ukur kemudian diaduk kembali. Volume campuran ditepatkan hingga tanda tera dengan akuades, kemudian disaring dengan kertas saring abu. Filtrat hasil penyaringan dipipet 5 ml ke dalam dua tabung reaksi berukuran 18 x 100 mm. Tabung pertama ditambahkan 5 ml akuades, sedangkan tabung kedua (pembanding) ditambahkan 5 ml NaHSO 3 0,2%. Campuran diaduk rata dengan menggunakan pengaduk vortex. Tahap berikutnya sampel diabsorbansi dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 284 nm dan 336 nm dengan sel satu cm. Apabila absorbansi di atas 0,6 larutan sampel diencerkan lagi dengan akuades sedangkan larutan pembanding diencerkan dengan cara sama dengan menggunakan larutan NaHSO 3 0,1%. Nilai absorbansi yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengencer sebelum perhitungan. 22
Perhitungan : Kadar HMF (mg/100 g madu) = ((A284 A336) : BC (g)) x 14,97 x BC (g) Keterangan : A284 : Absorbansi pada 284 nm A336 : Absorbansi pada 336 nm 14,97 : Faktor koreksi BC : Berat contoh (g) Kadar Gula (Instrument HPLC) (Standar Nasional Indonesia 01-3545-2004). Pengukuran kadar gula dalam madu meliputi sukrosa, glukosa dan fruktosa menggunakan instrument High Performance Liquid Cromatografi (HPLC) CTO- 20A. Uji gula dilakukan dengan tiga tahapan yakni stabilisasi alat (HPLC), penguntikan standar, dan penyuntikan sampel dengan Syringe 100F-LC. Stabilisasi alat dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak (25% air dan 75% acetonitril) dalam instrument HPLC selama satu jam. Tahap selanjutnya adalah penyuntikan standar. Standar yang digunakan adalah sukrosa, fruktosa, dan glukosa murni. Sebanyak 10 gram sampel dari masingmasing standar dilarutkan dalam 100 ml air (air bebas ion yang telah disaring dengan membran 0,45 mikrometer). Selanjutnya 10 ml hasil larutan diambil disaring dengan membran 0,2 mikrometer. Sampel yang telah disaring diambil dengan menggunakan syringe gelas sebanyak 100 mikroliter kemudian disuntikan pada HPLC dan diamkan agar tekanan pada HPLC stabil (pada pengukuran ini tekanan berada pada 75 kgf). Pada saat tekanan telah stabil kembali, semua kandungan standar telah keluar dalam bentuk grafik (telihat dalam monitor). Pada penelitian ini, semua kandungan standar fruktosa, sukrosa dan glukosa sudah keluar sebelum 16 menit. Berdasarkan penyuntikan standar diketahui bahwa puncak fruktosa akan keluar kurang lebih pada menit ke 7 lebih 24 detik, kemudian puncak glukosa keluar pada menit ke 8 lebih 30 detik, dan puncak sukrosa keluar pada menit ke 11 lebih 30 detik. Setelah HPLC distandarisasi untuk pengujian sukrosa, glukosa dan fruktosa, dilakukan penyuntikan sampel madu. Semua sampel madu diencerkan dengan cara 1 gram madu diencerkan dalam 10 ml air (yang telah disaring dengan membran 0,45 mikrometer). Sampel yang telah diencerkan diambil dengan syringe gelas sebanyak 100 mikroliter dan disuntikkan dalam HPLC. Puncak atau grafik fruktosa, glukosa 23
dan sukrosa akan keluar dan kemudian dihitung konsentrasinya dalam persen dengan rumus : Konsentrasi gula = Luas grafik daerah sampel x Berat jenis x 10x 100% Luas grafik daerah standar Bobot sampel Rancangan dan Analisis Data Penelitian ini menggunakan metode One Zero Sampling dan data dianalisis secara deskriptif. Persentase hasil uji kemurnian madu dihitung dengan rumus: Persentase hasil uji = x 100% Keterangan : a : Jumlah keberhasilan dalam setiap uji 5 : Jumlah ulangan dalam setiap uji Madu yang lolos uji kemurniannya (persentase kemurnian di atas 50%) dianalisa lebih lanjut secara kimia. Semua sampel madu yang telah diuji ketidakmurniannya dihitung persentasenya dan hasilnya dianalisis secara deskriptif. 24