III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Alat dan bahan tercantum dalam Lampiran 1. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni-Juli 2014. B. Diagram Alir Penelitian Pengambilan sampel secara acak (random sampling) di berbagai lokasi yang terdapat Syzygium samarangense dan Syzygium aqueum Sampel daun jambu Pembuatan preparat segar daun Pembuatan preparat awetan daun Menghitung jumlah dan ukuran (panjang dan lebar stomata) Mengukur lebar sel epidermis atas, tebal sel epidermis atas, lebar sel epidermis bawah, tebal sel epidermis bawah, panjang palisade, dan diameter palisade Karakter anatomi daun yang didapat kemudian dianalis menggunakan software MEGA 5.0 untuk mengetahui kemiripannya C. Metode Penelitian 1. Metode Penelitian Hasil berupa karakter anatomi daun dan analisis kemiripan Syzygium samarangense dan Syzygium aqueum Metode yang digunakan adalah metode survai dengan teknik pengambilan sampel acak terpilih (purposive random sampling). 7
2. Parameter Penelitian Menghitung jumlah dan ukuran (panjang dan lebar stomata), lebar sel epidermis atas, tebal sel epidermis atas, lebar sel epidermis bawah, tebal sel epidermis bawah, panjang palisade, dan diameter palisade. D. Cara Kerja Penelitian 1. Pengambilan Sampel Daun Sampel daun jambu air dipilih didasarkan pada pekarangan yang memiliki tumbuhan jambu air dari beberapa lokasi dan diambil daun kedua dari pucuk. 2. Pembuatan Preparat Segar Daun Sampel daun jambu air yang diteliti karakteristik stomatanya dibuat preparat segar menurut Rompas et al. (2011) sebagai berikut: 2.1. Setiap sampel daun diolesi dengan kutek pada bagian bawah daun, tunggu selama + 3 menit 2.2. Selanjutnya lapisan kutek yang sudah kering diambil dengan pinset dan dilekatkan di atas gelas benda dan tetesi air kemudian ditutup dengan gelas penutup. 2.3. Preparat segar kemudian diamati di bawah mikroskop binokuler. 3. Pembuatan Preparat Anatomi Daun Pembuatan preparat permanen organ daun dengan metode parafin, pewarnaan dengan safranin 1% dalam alkohol 70% menurut Sass (1958) adalah sebagai berikut: 3.1. Daun dipotong ± 1 cm menggunakan silet yang tajam. 3.2. Fiksasi: potongan daun tersebut kemudian dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi larutan fiksatif FAA selama 24 jam. Komposisi larutan fiksatif FAA: Alkohol : 90 ml Asam asetat glacial : 5 ml Formalin : 5 ml 3.3. Dehidrasi: masukkan daun ke dalam alkohol bertingkat secara bergantian masing-masing selama 30 menit: Alkohol 70% Alkohol 80% Alkohol 90% 8
Ethanol 3.4. Dealkoholisasi: masukkan daun ke dalam alkohol/xylol dan xylol bertingkat secara bergantian masing-masing selama 30 menit: alkohol/xylol 3:1 alkohol/xylol 1:1 alkohol/xylol 1:3 Xylol 1 Xylol 2 3.5. Infiltrasi Potongan daun dimasukkan ke dalam campuran xylol/parafin 1:9 selama 24 jam di dalam oven dengan temperatur 57ºC. Setelah 24 jam, campuran xylol/parafin 1:9 diganti dengan parafin murni selama 2 jam di dalam oven dengan temperatur 57ºC. 3.6. Pembuatan blok: Potongan daun dimasukkan ke dalam kotak karton yang berisi parafin cair dengan posisi di tengah sehingga tepat terselubungi oleh parafin dan dibiarkan membeku. 3.7. Penempelan blok parafin: Parafin dilepaskan dari kotak karton, dipotong sedemikian rupa, lalu ditempel pada kayu (holder) menurut arah sayatan, dilakukan dengan mencairkan sebagian blok parafin dengan skalpel yang telah dipanasi kemudian diletakkan pada kayu (holder). 3.8. Pengirisan: Blok parafin yang berisi sampel daun diiris dengan mikrotom putar, dengan tebal irisan ±10 µm. 3.9. Pita-pita parafin diletakkan diatas gelas benda yang telah diolesi dengan campuran gliserin/albumin 1:1, lalu ditetesi air. Selanjutnya gelas benda diletakkan di atas pemanas (hot plate) sampai kering. 3.10. Pewarnaan: Gelas benda direndam kedalam staining jar dengan urutan dan lama waktu sebagai berikut: Larutan xylol I Larutan xylol II Xylol : Alkohol (3:1) Xylol : Alkohol (1:1) Xylol : Alkohol (1:3) Ethanol 9
Alkohol 90% Alkohol 80% Alkohol 70% Safranin 1% dalam alkohol 70% Alkohol 70% Alkohol 80% Alkohol 90% Ethanol Xylol : Alkohol (3:1) Xylol : Alkohol (1:1) Xylol : Alkohol (1:3) Xylol I Xylol II : 1-2 jam 3.11. Penutupan: Irisan daun ditetesi dengan entellan lalu ditutup dengan gelas penutup, diberi label yang berisi nama preparat dan dikeringkan di atas hotplate. 3.12. Preparat diamati dibawah mikroskop. 4. Kalibrasi Kalibrasi dilakukan untuk mencari nilai skala mikrometer okuler, menurut Sass (1958) adalah sebagai berikut: 4.1. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, diatur hingga terlihat bayangan skala mikrometer okuler dengan jelas. 4.2. Mikrometer objektif dipasang pada meja objektif mikroskop, diatur hingga terlihat bayangan skala mikrometer objektif dengan jelas. 4.3. Bayangan skala mikrometer okuler dan mikrometer objektif kemudian dihimpitkan. 4.4. Jumlah skala mikrometer okuler dan mikrometer objektif yang berhimpit tersebut kemudian dihitung 5x ulangan. 4.5. Jarak sesungguhnya antara kedua garis skala mikrometer dihitung dengan rumus: X Sob = Y Sok (3-1) x 10
x 10 5. Menghitung Jumlah Stomata Menghitung jumlah stomata menurut Lestari (2006) adalah sebagai berikut: 5.1. Mikrometer square dipasang pada lensa objektif mikroskop. 5.2. Preparat segar daun jambu diletakkan di atas meja preparat mikroskop kemudian dicari fokusnya. 5.3. Jumlah stomata dihitung pada perbesaran 100x. 5.4. Perhitungan dilakukan dengan 5 bidang lapang pandang yang berbeda. 5.5. Rumus perhitungan: Kerapatan (3-2) 6. Mengukur Ukuran (Panjang dan Lebar) Stomata Mengukur ukuran panjang dan lebar stomata menurut Sulistyaningsih et al. (1994) adalah sebagai berikut: 6.1. Preparat segar daun jambu diletakkan pada meja preparat mikroskop kemudian dicari fokus bayangan preparat. 6.2. Letak mikrometer okuler diatur sesuai dengan panjang dan lebar stomata kemudian diukur pada perbesaran 400x. 6.3. Pengukuran panjang dan lebar stomata dilakukan hingga 5x ulangan. 7. Mengukur Epidermis dan Palisade Mengukur epidermis (panjang dan lebar) dan palisade (panjang dan diameter) menurut Sulistyaningsih et al. (1994) adalah sebagai berikut: 7.1. Preparat awetan daun jambu diletakkan pada meja preparat mikroskop kemudian dicari fokus bayangan preparat. 7.2. Letakkan mikrometer okuler diatur sesuai dengan cara kalibrasi, pengukuran diukur pada perbesaran 400x. 7.3. Pengukuran dilakukan hingga 5x ulangan. 8. Analisis Hubungan Kemiripan Syzygium samarangense dan Syzygium aqueum Analisis hubungan kemiripan berdasarkan sifat anatominya, data anatomi dianalisis dengan UPGMA menggunakan software MEGA 5.0 (Tamura, et al., 2010) 11
Cara analisis data adalah sebagai berikut: 8.1. Menetapkan sifat dari semua karakter yang ada dengan angka 0, 1, 2, & 3. 8.2. Dimasukkan dalam tabel di microsoft excel. 8.3. Dicopy & paste ke microsoft word kemudian dimerge. 8.4. Direplace 0 menjadi A, 1 menjadi T, 2 menjadi G, dan 3 menjadi C. 8.5. Dicopy & paste ke software MEGA. 8.6. Memilih Phylogeny kemudian bootstrap test of Phylogeny. 8.7. Memilih UPGMA dan akan terlihat fenogram yang tebentuk. 8.8. Melihat indeks disimilaritas dengan memilih distance kemudian compute pairwise. E. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif, untuk menggambarkan dan menginterpretasi struktur anatomi daun jambu. 12