4 Hasil dan Pembahasan 4.1 Pembiakkan Mikroorganisme Koloni tunggal Actinomycetes dalam media LB padat tampak sebagai bulatan berwarna putih kekuningan. Koloni tunggal dihasilkan setelah inkubasi semalam. Dari identifikasi secara visual bentuk dan warna mikroorganisme yang dihasilkan serupa dengan literatur. Pada gambar 4.1, bagian yang dilingkari adalah koloni tunggal yang teramati. Pembiakan lebih lanjut dalam media cair NB memberikan hasil setelah inkubasi selama 4 hari. Larutan media NB cair semula berwarna kuning kecoklatan bening, namun setelah pengocokan menjadi keruh. Ini menunjukan sel-sel Actynomycetes tumbuh. Actinomycetes memerlukan waktu lebih panjang dalam lack phase saat ditumbuhkan. Oleh karena itulah sel-sel Actynomycetes dalam media NB cair baru tumbuh setelah waktu pengocokan yang lebih lama dibandingkan mikroorganisme lain. Gambar 4.1 Hasil pembiakan Actinomycetes dalam media LB padat Gambar 4.2 Hasil pambiakan koloni tunggal Actinomycetes dalam media NB cair
Untuk Serratia marcescens, koloni tunggal diperoleh pada media padat setelah inkubasi semalam. Menurut literatur, Serratia marcescens akan menghasilkan pigmen berwarna merah pada suhu ruang. Pembiakkan pada media padat menghasilkan koloni tunggal putih kemerahan. Namun setelah inkubasi diteruskan warna merah menjadi semakin nyata. Pada gambar 4.3 berturut-turut dari kiri ke kanan adalah hasil inkubasi selama satu, dua, dan tiga malam dalam inkubator 37 0 C. Bagian yang dilingkari pada gambar hasil inkubasi semalam adalah koloni tunggal yang teramati. Koloni tunggal yang diperoleh setelah inkubasi selama semalam dibiakan lebih lanjut pada media NB cair. Media cair sudah nampak keruh setelah pengocokkan semalam (gambar 4.4). Hal ini membuktikan bahwa bakteri (Serratia marcescens) berkembang biak lebih cepat dibandingkan higher bacteria (Actinomycetes). Gambar 4.3 Hasil pembiakan Serratia marcescens dalam media LB padat Gambar 4.4 Hasil pembiakan koloni tunggal Serratia marcescens dalam media NB cair Koloni tunggal Candida albicans yang dihasilkan setelah inkubasi semalam berwarna putih kekuningan. Bentuknya bulat. Dilihat dari bentuk dan warnanya mirip dengan Actinomycetes. Hanya saja ukuran koloni tunggal Candida albicans lebih besar. Bagian yang dilingkari pada gambar 4.5 adalah koloni tunggal teramati. Pembiakkan koloni tunggal dalam media NB cair hanya membutuhkan waktu semalam saja. Warna larutan semula kuning kecoklatan bening. Setelah inkubasi semalam larutan telah menjadi keruh (gambar 4.6) 25
Gambar 4.5 Hasil pembiakan Candida albicans dalam media LB padat Gambar 4.6 Hasil pembiakan koloni tunggal Candida albicans dalam madia LB cair 4.2 Identifikasi Aktivitas Antijamur Actinomycetes dan Serratia marcescens Ekstrasel Setelah kultur cair Candida albicans disebar di permukaan media padat LB, di atasnya diletakkan tiga buah paper disc yang telah dicelupkan pada kultur cair Actinomycetes Serratia marcescens, dan larutan ketoconazole. Setelah diinkubasi semalam tampak Candida albicans tumbuh di permukaan media padat LB. Permukaan LB yang semula bening menjadi terlihat dilapisi lapisan putih kekuningan. Di sekitar paper disc terlihat daerah yang masih bening. Ini menunjukkan pada daerah tersebut tidak tumbuh Candida albicans. Diameter zona bening Actinomycetes berukuran 0,7cm, Serratia marcescens 0,8cm, sedangkan ketoconazole berukuran 0,9cm. Sepintas terlihat Serratia marcescens memiliki aktivitas antijamur lebih besar dibandingkan Actinomycetes. Namun diperlukan analisis lain seperti penghitungan berat protein kitinase total yang dihasilkan masing-masing mikroorganisme untuk mencapai kesimpulan seperti itu. 26
1 3 2 Gambar 4.7 Aktivitas antijamur Actinomycetes, Serratia marcescens, dan ketoconazole 4.3 Identifikasi Aktivitas Antijamur Actinomycetes dan Serratia marcescens Intrasel Sentrifugasi mengendapkan sekaligus memisahkan sel-sel Actinomycetes dan Serratia marcescens dari media cair. Pencucian dengan NaCl bertujuan menghilangkan media yang masih menempel pada permukaan sel Actinomycetes dan Serratia marcescens. Larutan mikroorganisme dalam media semula berwarna coklat bening. Setelah media dipisahkan dari sel-sel mikroorganisme dihasilkan endapan putih yang merupakan sel-sel Actinomycetes. Sedangkan endapan Serratia marcescens setalah disentrifugasi pada 4 0 C berwarna putih. Setelah selang waktu berada pada suhu ruang endapan nampak kemerahan. Ini menunjukkan aktivitas pigmen merah Serratia marcescens. Setelah dicuci dengan NaCl sebanyak tiga kali endapan sel dilarutkan dalam air. Kemudian dilakukan sonikasi. Proses sonikasi dilakukan sampai terlihat bintik hitam yang menandakan dinding sel mikroorganisme telah terbuka. Setelah proses sonikasi, dilakukan uji aktivitas antijamurnya terhadap lawn Candida albicans. 1 2 3 Gambar 4.8 Aktivitas antijamur cairan intrasel Actinomycetes, Serratia marcescens, dan ketoconazole 27
4.4 Isolasi Kitin dari Kulit Udang Jerbun Hasil akhir berupa serbuk kitin berwarna jingga. Beberapa prosedur menyarankan dilakukan pemutihan atau bleaching. Namun dalam percobaan tidak dilakukan karena warna sebuk kitin yang berbeda dari warna media padat akan memudahkan pengamatan aktivitas kitinase Actinomycetes dan Serratia marcescens. 4.5 Identifikasi Aktivitas Kitinase Actinomycetes dan Serratia marcescens Awalnya serbuk kitin yang ditambahkan pada media cair LB 0,8% bacto agar adalah 3 mg. Hasilnya lapis tipis kitin kurang merata di seluruh permukaan media padat LB. Kemudian jumlah serbuk kitin ditambah menjadi 10mg. Namun hasilnya zona bening di sekitar paper disc tidak nampak karena kitin yang didegradasi terlalu banyak. Setelah dicoba beberapa kali dengan melakukan variasi jumlah serbuk kitin yang digunakan, diperoleh berat optimum agar zona bening aktivitas kitinase nampak cukup jelas adalah 6 mg. Metode paper disc memberikan hasil setelah inkubasi semalam.zona bening yang diamati setelah inkubasi adalah 0,6 cm disekitar paper disc Actinomycetes. Di sekitar paper disc Serratia marcescens juga diamati adanya zona bening dengan ukuran 0,6 cm. Sepintas terlihat aktivitas antijamur Serratia marcescens dan Actinomycetes sama, namun diperlukan analisis lain seperti penghitungan berat protein kitinase total yang dihasilkan masing-masing mikroorganisme untuk mencapai kesimpulan seperti itu. Gambar 4.9 Aktivitas kitinase Actinomycetes dan Serratia marcescens 4.6 Identifikasi Aktivitas Antijamur Getah Pohon Karet Hasil yang diperoleh manunjukkan zona bening hanya tampak pada daerah di sekeliling paper disc yang dicelupkan pada larutan getah karet dalam toluen p.a.(gambar 4.10 kiri). Diameter zona bening yang diamati sebesar 0,8cm. Selebihnya didak ditemukan zona bening. Toluen bersifat merusak struktur protein. Oleh karena itu disimpulkan zona bening yang nampak bukan aktivitas kitinase. Zona bening juga disimpulkan bukan reaksi antara toluen dengan sel-sel Candida albicans karena paper disc yang dicelupkan pada toluen tidak memberikan zona bening (gambar 4.10 kanan). 28
Gambar 4.10 Aktivitas antijamur getah tanaman karet dan kontrol negatif toluen p.a. 4.7 Fraksinasi Kitinase yang Dihasilkan Actinomycetes dan Identifikasi Aktivitas Antijamurnya Protein yang diperoleh hanya dari fraksi 20% ammoniun sulfat. Jadi yang diuji aktivitas antijamurnya hanya fraksi tersebut. Fraksi ammonium sulfat 40%, 60%, dan 80% tidak memberikan endapan. Artinya, pada fraksi-fraksi tersebut tidak ditemukan protein, dalam hal ini kitinase. Zona bening yang dihasilkan berukuran 1,1cm (gambar 4.11 kiri). Zona bening yang dihasilkan dari proses fraksinasi jauh lebih jelas dibandingkan hasil percobaan yang lain. Ini menunjukkan protein yang terfraksinasi cukup banyak sehingga mampu mendegragasi kitin pada dinding sel jamur lebih banyak. Sebagai kontrol positif digunakan obat antijamur kalpanax. Pada gambar 4.11 bagian kanan nampak zona bening sebesar 1,3 cm. Kalpanax mengandung asam salisilat 4%, asam benzoat 4%, dan povidon iodin 5% dalam 10 ml larutan. Gambar 4.11 Aktifitas antijamur fraksi 1 Actinomycetes dan control positif kalpanax 29