METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2008 sampai bulan September 2009. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak Perah dan Laboratorium Ruminansia Besar, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Materi Bahan-bahan utama yang digunakan adalah isolat bakteri asam laktat asal daging yaitu Lactobacillus fermentum 2B2 dan bakteri indikator (patogen) (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Eschericia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, dan enteropatogenik Escherichia coli lokal) untuk tahap produksi bakteriosin. Tahap purifikasi parsial bakteriosin, serta tahap kepekaan enzim katalase dan proteolitik tanpa menggunakan Escherichia coli ATCC 25922. Pada tahap MIC dan MBC hanya menggunakan bakteri uji S. aureus. Media yang digunakan yaitu de Man Ragosa Sharp Broth (MRSB), Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Buffer Pepton Water (BPW), Muller Hilton Agar (MHA), Yeast Extract (YE), NaCl, tripton, NaOH 1 N, amonium sulfat, enzim katalase, tripsin, pepsin, KH 2 PO 4 0,05 M Tris Hydrochloride (ph 8,0), 0,2 M sitrat (ph 6,0), larutan Mc. Farland No. 0,5, es batu, dan aquadest. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Ose, cawan Petri, tabung reaksi, sentrifuse, kertas saring, alumunium foil, karton coklat, plastik wrap, timbangan, autoclaf, alat titrasi, gelas ukur, pipet, pipet pasteur, pipet mikro, tip, tabung ependorf, millipore 0,22 µm, tabung Erlenmeyer, tabung Scott, spuit volume 10 ml, dan jangka sorong. Rancangan Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan 3 ulangan untuk tahap produksi bakteriosin, karakterisasi bakteriosin, dan konsentrasi minimum inhibitor. Perlakuannya yaitu penggunaan media yang berbeda pada tahap produksi dan karakterisasi bakteriosin, perbedaan konsentrasi substrat kasar bakteriosin pada tahap MIC dan MBC. Model matematikanya sebagai berikut: Y ij = µ + B i + ε ij
Keterangan : Y ij : Nilai respon perlakuan media yang berbeda pada substrat kasar bakteriosin terhadap bakteri indikator µ : Nilai tengah populasi B i ε ij : Pengaruh media yang berbeda (tahap produksi dan purifikasi parsial bakteriosin) dan perbedaan konsentrasi substrat kasar bakteriosin (tahap MIC dan MBC) : Pengaruh galat percobaan Rancangan percobaan lainnya yang digunakan adalah metode statistik deskritif untuk optimasi produksi bakteriosin, purifikasi parsial bakteriosin, konsentrasi minimum inhibitor, uji enzim katalase dan proteolitik. Prosedur Produksi Bakteriosin pada Media yang Berbeda Penyegaran Bakteri Asam Laktat Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 dari media MRSB dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB yang ditambah YE 3% (9 ml), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Produksi Bakteriosin dari Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 hasil penyegaran berumur 24 jam dipipet sebanyak 2 ml dan dimasukkan ke dalam 3 media (masing-masing media sebanyak 18 ml) yaitu (1) MRSB dan NaCl 1% ; (2) MRSB, YE 3 %, dan NaCl 1%; serta (3) MRSB dan tripton 1%, masingmasing disiapkan untuk ph 5,0 dan ph 6,0 (ada 6 tabung). Kultur yang dihasilkan untuk setiap media sebanyak 20 ml. Kultur L. fermentum kemudian diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0 C. Kultur L. fermentum 2B2 umur 20 jam tersebut dimasukkan ke dalam ependorf sesuai dengan medianya masing-masing, kemudian disentrifuse selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 0 C. Supernatan bebas sel yang dihasilkan dari setiap media dipisahkan dengan endapannya. Supernatan bebas sel dimasukkan dalam tabung untuk diukur ph awalnya, sedangkan sebagian kecil substrat disisihkan untuk diukur total asam tertitrasi (TAT). Supernatan pada setiap media dikondisikan menjadi ph 5,0 dan ph 15
6,0 dengan penambahan NaOH 1 N. Supernatan yang telah dikondisikan phnya diukur kembali TATnya. Supernatan bebas sel pada ph 5,0 dan ph 6,0 disterilkan dengan cara disaring menggunakan filter 0,22 µm (millipore). Supernatan bebas sel tersebut digunakan dalam uji antagonistik (konfrontasi) dengan bakteri indikator. Produksi Bakteri Indikator sebagai Kultur Kerja. Masing-masing bakteri indikator (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Eschericia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, dan enteropatogenik Escherichia coli lokal) diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Bakteri indikator umur 24 jam distandarisasi jumlahnya dengan cara disetarakan kekeruhannya sesuai standar Mc Farland no. 0,5 didalam media NaCl sehingga dihasilkan populasi bakteri setara 1,5 x 10 8 sel bakteri/ml. Konfrontasi bakteri indikator dengan substrat bakteriosin pada tahap produksi bakteriosin menggunakan konsentrasi bakteri 1,5 x 10 6 sel bakteri/ml yang diperoleh dengan cara mengencerkannya 100 kali dalam buffer pepton water (BPW) steril. Konfrontasi Substrat Kasar Bakteriosin dengan Bakteri Indikator. Supernatan bebas sel (substrat kasar bakteriosin) pada setiap media dengan masing-masing ph 5,0 dan ph 6,0 dikonfrontasi dengan keempat bakteri indikator dengan metode difusi agar. Bakteri indikator dimasukkan ke dalam cawan sebanyak 1 ml kemudian dituang media MHA sebanyak 25 ml. Cawan digerakkan membentuk angka delapan untuk menghomogenkan media dengan bakteri. Agar yang telah mengeras dilubangi dengan menggunakan pipet Pasteur (diameter 5 mm) dan agarnya dibuang dengan menggunakan Ose. Supernatan bebas sel dimasukkan ke dalam lubang tersebut sebanyak 50 µl. Cawan ditutup dengan kertas saring kemudian ditutup dengan penutup cawan. Cawan dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 2 jam kemudian diinkubasi selama 20 jam. Zona bening yang dihasilkan diukur diameternya. Purifikasi Parsial Bakteriosin Penyegaran Bakteri Asam Laktat Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 dari media MRSB dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB yang ditambah YE 3% (9 ml), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. 16
Produksi Bakteriosin dari Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 hasil penyegaran berumur 24 jam dipipet sebanyak 7 ml dan dimasukkan ke dalam 3 media (masing-masing media sebanyak 63 ml) yaitu (1) MRSB dan NaCl 1% ; (2) MRSB, YE 3 %, dan NaCl 1%; serta (3) MRSB dan tripton 1%. Kultur yang dihasilkan untuk setiap media sebanyak 70 ml. Kultur L. fermentum kemudian diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0 C. Kultur L. fermentum 2B2 umur 20 jam tersebut dimasukkan ke dalam ependorf kemudian disentrifuse selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 0 C. Supernatan bebas sel yang dihasilkan dari setiap media dipisahkan dengan endapannya. Supernatan bebas sel dimasukkan ke dalam tabung untuk diukur ph awalnya. Supernatan pada setiap media dikondisikan menjadi ph 6,0 dengan penambahan NaOH 1 N. Supernatan bebas sel dengan ph 6,0 disterilkan dengan cara disaring menggunakan filter 0,22 µm (millipore) kemudian ditambahkan amonium sulfat sebanyak 40% pada setiap media. Gerakkan wadah substrat tersebut secara perlahan hingga seluruh amonium sulfat larut didalam substrat. Substrat didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin. Substrat yang telah didiamkan semalaman tersebut akan menghasilkan protein yang mengapung diatas substrat. Protein dipisahkan dengan sebagian besar substrat dengan mengeluarkan substrat yang berada di bawah protein yang mengapung. Protein (substrat kasar bakteriosin) tersebut ditambahkan dengan buffer KH 2 PO 4. Substrat kasar bakteriosin tersebut digunakan dalam uji antagonistik (konfrontasi) dengan bakteri indikator. Produksi Bakteri Indikator sebagai Kultur Kerja. Masing-masing bakteri indikator (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 14028, dan enteropatogenik Escherichia coli lokal) diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Bakteri indikator umur 24 jam distandarisasi jumlahnya dengan cara disetarakan kekeruhannya sesuai standar Mc Farland no. 0,5 dalam media NaCl sehingga dihasilkan populasi bakteri setara 1,5 x 10 8 sel bakteri/ml. Konfrontasi Substrat Kasar Bakteriosin dengan Bakteri Indikator. Substrat kasar bakteriosin pada ph 6,0 dikonfrontasi dengan ketiga bakteri indikator dengan metode difusi agar. Bakteri indikator dimasukkan ke dalam cawan sebanyak 1 ml kemudian dituang media MHA sebanyak 25 ml. Cawan digerakkan membentuk angka delapan untuk menghomogenkan media dengan bakteri. Agar yang telah 17
mengeras dilubangi dengan menggunakan pipet Pasteur (diameter 5 mm) dan agarnya dibuang dengan menggunakan Ose. Substrat kasar bakteriosin dimasukkan ke dalam lubang tersebut sebanyak 50 µl. Cawan ditutup dengan kertas saring kemudian ditutup dengan penutup cawan. Cawan dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 2 jam kemudian diinkubasi selama 20 jam. Zona bening yang dihasilkan diukur diameternya. Konsentrasi Penghambatan Minimum (MIC dan MBC) Penyegaran Bakteri Asam Laktat Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 dari media MRSB dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB yang ditambah YE 3% (9 ml), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Produksi Bakteriosin dari Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 hasil penyegaran berumur 24 jam dipipet sebanyak 7 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB ditambah tripton 1% (63 ml). Kultur yang dihasilkan sebanyak 70 ml. Kultur L. fermentum kemudian diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0 C. Kultur L. fermentum 2B2 umur 20 jam tersebut dimasukkan ke dalam ependorf kemudian disentrifuse selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 0 C. Supernatan bebas sel yang dihasilkan dari setiap media dipisahkan dengan endapannya dengan dimasukkan dalam tabung untuk diukur ph awal. Supernatan pada setiap media dikondisikan menjadi ph 6,0 dengan penambahan NaOH 1 N. Supernatan bebas sel dengan ph 6,0 disterilkan dengan cara disaring menggunakan filter 0,22 µm (millipore) kemudian ditambahkan amonium sulfat sebanyak 40% dalam setiap media. Gerakkan wadah substrat tersebut secara perlahan hingga seluruh amonium sulfat larut didalam substrat. Substrat didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin. Substrat yang telah didiamkan semalaman tersebut akan menghasilkan protein yang mengapung diatas substrat. Protein dipisahkan dengan sebagian besar substrat dengan mengeluarkan substrat yang ada di bawahnya, kemudian ditambahkan dengan buffer KH 2 PO 4. Substrat kasar bakteriosin tersebut digunakan dalam uji antagonistik (konfrontasi) dengan bakteri indikator. Produksi Bakteri Indikator sebagai Kultur Kerja. Bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Bakteri S. aureus ATCC 18
25923 umur 24 jam yang akan digunakan distandarisasi jumlahnya dengan cara disetarakan kekeruhannya sesuai standar Mc Farland no. 0,5 dalam media NaCl sehingga dihasilkan populasi bakteri setara 1,5 x 10 8 sel bakteri/ml. Media NB, substrat kasar bakteriosin, dan bakteri indikator dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan perbandingan volume pada (Tabel 2.), kemudian divortex agar menyatu. Kultur tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cawan ditambahkan dengan MHA kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Tabel 2. Volume Media NB, Substrat Kasar Bakteriosin, dan Bakteri Indikator Media NB Substrat Kasar Bakteriosin Bakteri Indikator ----------------------------------------- ml ------------------------------------------------------ 4,5 0 0,5 4,0 0,5 0,5 3,5 1,0 0,5 3,0 1,5 0,5 2,5 2,0 0,5 2,0 2,5 0,5 1,5 3,0 0,5 1,0 3,5 0,5 0,5 4,0 0,5 0 4,5 0,5 Pertumbuhan bakteri indikator pada setiap cawan dihitung secara manual. Perhitungan jumlah koloni meggunakan metode Aerobic Plate Count pada Bacteriological Analytical Manual (BAM, 2001). Rumus Hitung APC: 1. Cawan dengan jumlah koloni 25-250 19
Formula: N = C x d [(1x N1) + (0,1x N2)] Keterangan: N C N1 N2 d : Jumlah koloni per ml atau g produk : Jumlah semua koloni pada cawan yang dapat dihitung : Jumlah koloni pada cawan pengenceran pertama yang dapat dihitung : Jumlah koloni pada cawan pengenceran kedua yang dapat dihitung : Faktor pengencer dari perhitungan pertama dihasilkan 2. Cawan dengan jumlah koloni kurang dari 25 Hitung jumlah yang ada pada cawan dari setiap pengenceran. Rerata jumlah koloni per cawan dan kalikan dengan faktor pengencer dari jumlah perhitungan pertama dihasilkan. 2. Cawan dengan jumlah koloni lebih dari 250 Hitung koloni pada cawan kemudian dikali dengan faktor pengencer. Uji Kepekaan Substrat Kasar Bakteriosin terhadap Enzim Katalase Penyegaran Bakteri Asam Laktat Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 dari media MRSB dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB yang ditambah YE 3% (9 ml), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Produksi Bakteriosin dari Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 hasil penyegaran berumur 24 jam dipipet sebanyak 7 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB ditambah tripton 1% (63 ml). Kultur yang dihasilkan sebanyak 70 ml. Kultur L. fermentum kemudian diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0 C. Kultur L. fermentum 2B2 umur 20 jam tersebut dimasukkan ke dalam ependorf kemudian disentrifuse selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 0 C. Supernatan bebas sel yang dihasilkan dari setiap media dipisahkan dengan endapannya dengan dimasukkan dalam tabung untuk diukur ph awal. Supernatan pada setiap media dikondisikan menjadi ph 6,0 dengan penambahan NaOH 1 N. Supernatan bebas sel dengan ph 6,0 disterilkan dengan cara disaring menggunakan filter 0,22 µm (millipore) kemudian ditambahkan amonium sulfat sebanyak 40% dalam setiap media. Gerakkan wadah substrat tersebut secara perlahan hingga seluruh amonium sulfat larut didalam substrat. Substrat didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin. Substrat yang telah didiamkan semalaman tersebut akan menghasilkan protein yang mengapung diatas substrat. Protein (substrat kasar 20
bakteriosin) dipisahkan dengan sebagian besar substrat dengan mengeluarkan substrat yang ada di bawahnya, kemudian ditambahkan dengan buffer KH 2 PO 4. Substrat kasar bakteriosin tersebut digunakan dalam uji antagonistik dengan bakteri indikator. Produksi Bakteri Indikator sebagai Kultur Kerja. Bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Bakteri S. aureus ATCC 25923 umur 24 jam yang akan digunakan distandarisasi jumlahnya dengan cara disetarakan kekeruhannya sesuai standar Mc Farland no. 0,5 sehingga dihasilkan populasi bakteri setara 1,5 x 10 8 sel bakteri/ml. Penggabungan Substrat Kasar Bakteriosin dengan Enzim Katalase. Enzim katalase (2,0 U/mg) distabilkan dengan buffer 10 mm potasium fosfat yang dikondisikan pada ph 7.0 dengan penambahan NaOH 1 N. Sampel substrat kasar bakteriosin sebanyak 1 ml dicampur dengan 1 mg/ml enzim katalase (1 : 1), kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 o C (Savadogo et al., 2004). Konfrontasi Substrat Kasar Bakteriosin dengan Bakteri Indikator. Substrat kasar bakteriosin yang telah ditambahkan enzim katalase dikonfrontasi dengan bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dengan metode difusi agar. Bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dimasukkan ke dalam cawan sebanyak 1 ml kemudian dituang media MHA sebanyak 25 ml. Cawan digerakkan membentuk angka delapan untuk menghomogenkan media dengan bakteri. Agar yang telah mengeras dilubangi dengan menggunakan pipet Pasteur (diameter 5 mm) dan agarnya dibuang dengan menggunakan ose. Substrat kasar bakteriosin dimasukkan ke dalam lubang tersebut sebanyak 50 µl. Cawan ditutup dengan kertas saring kemudian ditutup dengan penutup cawan. Cawan dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 2 jam kemudian diinkubasi selama 20 jam. Zona bening yang dihasilkan diukur diameternya. Jika terdapat zona hambat pada uji antagonistik anatara bakteri indikator dengan substrat kasar bakteriosin yang diberi enzim katalase, maka menunjukkan bahwa substrat tersebut merupakan bakteriosin tanpa pengaruh dari sifat antimikroba hidrogen peroksida. 21
Uji Kepekaan Substrat Kasar Bakteriosin terhadap Enzim Proteolitik Penyegaran Bakteri Asam Laktat Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 dari media MRSB dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB yang ditambah YE 3% (9 ml), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Produksi Bakteriosin dari Lactobacillus fermentum 2B2. Kultur L. fermentum 2B2 hasil penyegaran berumur 24 jam dipipet sebanyak 7 ml dan dimasukkan ke dalam media MRSB ditambah tripton 1% (63 ml). Kultur yang dihasilkan sebanyak 70 ml. Kultur L. fermentum kemudian diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0 C. Kultur L. fermentum 2B2 umur 20 jam tersebut dimasukkan ke dalam ependorf kemudian disentrifuse selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 0 C. Supernatan bebas sel yang dihasilkan dari setiap media dipisahkan dengan endapannya dengan dimasukkan dalam tabung untuk diukur ph awal. Supernatan bebas sel dikondisikan menjadi ph 6,0 dengan penambahan NaOH 1 N. Supernatan bebas sel dengan ph 6,0 disterilkan dengan cara disaring menggunakan filter 0,22 µm (millipore) kemudian ditambahkan amonium sulfat sebanyak 40% dalam setiap media. Gerakkan wadah substrat tersebut secara perlahan hingga seluruh amonium sulfat larut didalam substrat. Substrat didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin. Substrat yang telah didiamkan semalaman tersebut akan menghasilkan protein yang mengapung diatas substrat. Protein dipisahkan dengan sebagian besar substrat dengan mengeluarkan substrat yang ada di bawahnya, kemudian ditambahkan dengan buffer KH 2 PO 4. Substrat kasar bakteriosin tersebut digunakan dalam uji antagonistik (konfrontasi) dengan bakteri indikator. Produksi Bakteri Indikator sebagai Kultur Kerja. Bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Bakteri S. aureus umur 24 jam yang akan digunakan distandarisasi jumlahnya dengan cara disetarakan kekeruhannya sesuai standar Mc Farland no. 0,5 sehingga dihasilkan populasi bakteri setara 1,5 x 10 8 sel bakteri/ml. Penggabungan Substrat Kasar Bakteriosin dengan Enzim Proteolitik. Enzimenzim dan buffernya yang digunakan secara berturut-turut yaitu tripsin (15000 U/mg) dalam 0,05 M buffer Tris Hidroklorid (ph 8,0), dan pepsin (3,2 U/ml) dalam 22
0,2 M buffer sitrat (ph 3,0). Sampel substrat kasar bakteriosin sebanyak 1 ml dicampur dengan 1 mg/ml masing-masing enzim proteolitik (1 : 1). Substrat kasar bakteriosin yang ditambahkan enzim pepsin diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 o C, sedangkan yang ditambahkan dengan enzim tripsin pada suhu 25 0 C (suhu kamar) (Savadogo et al., 2004). Konfrontasi Substrat Kasar Bakteriosin dengan Bakteri Indikator. Substrat kasar bakteriosin yang telah ditambahkan enzim proteolitik dikonfrontasi dengan bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dengan metode difusi agar. Bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dimasukkan ke dalam cawan sebanyak 1 ml kemudian dituang media MHA sebanyak 25 ml. Cawan digerakkan membentuk angka delapan untuk menghomogenkan media dengan bakteri. Agar yang telah mengeras dilubangi dengan menggunakan pipet Pasteur (diameter 5 mm) dan agarnya dibuang dengan menggunakan ose. Substrat kasar bakteriosin yang telah ditambahkan enzim proteolitik dimasukkan ke dalam lubang tersebut sebanyak 50 µl. Cawan ditutup dengan kertas saring kemudian ditutup dengan penutup cawan. Cawan dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 2 jam kemudian diinkubasi selama 20 jam. Zona bening yang dihasilkan diukur diameternya. Jika tidak terdapat zona hambat pada uji antagonistik antara bakteri indikator dengan substrat kasar bakteriosin yang diberi enzim proteolitik, maka menunjukkan bahwa substrat tersebut merupakan protein. 23