BAB VII DARAH A. SEDIAAN NATIF DARAH.

BAB VII DARAH A. SEDIAAN NATIF DARAH. Tujuan Praktikum Mengamati darah tanpa diproses lebih lanjut. 1. Memperhatikan bentuk-bentuk sel-sel darah ada tidaknya sel eritrosit yang mengalami krenasi (pengerutan), bentuk rouleaux sel-sel eritrosit, perbedaan antara eritrosit dan leukosit. 2. Mengamati ada tidaknya mikro organisme di dalam darah. Pemeriksaan darah yang rutin dilakukan di laboratorium klinik veteriner ialah pemeriksaan darah natif, kadar hemoglobin, hematokrit, menghitung jumlah eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih), trombosit, menghitung waktu beku. Dengan memilih beberapa macam pemeriksaan rutin tersebut di atas dapat digunakan sebagai prosedur screening. Hasil yang didapatkan ini digabung dengan hasil pemeriksaan klinik dan etiologi dapat memberikan informasi diagnostik yang sangat berharga, juga dapat dipakai sebagai indikasi jika diperlukan pemeriksaan lebih lanjut, lebih teliti dan spesifik. Disamping itu pemeriksaan darah dapat digunakan untuk mendapatkan gambaran kemampuan tubuh pasien untuk memerangi penyakit yang dideritanya, juga dapat merupakan indikator parah tidaknya keadaan penyakit. Dasar teori Rouleau (rouleaux, jamak) : suatu formasi eritrosit yang saling berlekatan membentuk deretan seperti uang logam yang dideretkan. Biasanya terlihat di dalam sediaan natif, darah kuda dan kucing yang sehat juga dapat terlihat pada anjing dan babi, tetapi jarang pada sapi, kambing dan domba. Mikroorganisme di dalam darah, misalnya larva dari Dirofilaria immitis pada anjing, Trypanosoma pada vertebrata pada umumnya dan lain-lainnya, berenang diantara sel-sel darah, dan dapat dideteksi dalam preparat natif dengan menggunakan mikroskop. Bahan dan alat 1. Jarum penusuk pembuluh darah/alat pengambil darah lainnya. 2. Alkohol 70%

3. Larutan fisiologis NaCl 0.9 % 4. Kapas 5. Kaca benda (object glass) dan kaca penutup (cover glass) 6. Mikroskop, dengan objektif 10x dan 40x, dan okuler 10x 7. Gunting (kalau perlu) Tata kerja - Bersihkan alat-alat yang akan dipakai untuk pemeriksaan ini - Bersihkan daerah pengambilan darah dengan alkohol 70%, bila daerah tersebut berbulu, hilangkan bulunya terlebih dahulu dengan menggunakan gunting. - Pada kaca benda teteskan 1-2 tetes larutan fisiologis NaCl. - Tusuk pembuluh darah, ambil darah dan teteskan pada kaca benda tadi yang telah ada larutan fisiologisnya. Campur dengan hati-hati, dan tutuplah dengan kaca penutup. - Letakkan di bawah mikroskop yang telah disediakan terlebih dahulu, dan amatilah dengan cermat dengan menggunakan pembesaran 100x, kemudian 400x. - Bila setelah selesai mikroskop harus dibersihkan lagi. Lembar kerja 1. Pengamatan eritrosit : Gambar butir-butir darah, yang diamati di bawah mikroskop. 2. Pengamatan sel lainnya :

3. Pengamatan terhadap ada tidaknya mikro-organisme di dalam darah : 4. Pengamatan lainnya : Pertanyaan 1. Dalam keadaan apa bentukan Rouleaux meningkat di dalam darah? 2. Apa perlunya bulu di daerah pengambilan darah dicukur/dihilangkan? 3. Apakah pemeriksaan ini dapat digunakan untuk mengamati macam-macam bentuk leukosit di dalam darah? jelaskan jawaban anda! B. KADAR HEMOGLOBIN (METODA SAHLI) Metoda ini masih banyak digunakan di lapangan dan laboratorium klinik, tetapi sudah jarang digunakan dalam penelitian, karena kurang akurat. Prinsip Darah dengan larutan HCl 0.1 N akan membentuk hematin yang berwarna coklat. Warna disamakan dengan warna standar sahli dengan menambahakan aquadestilata sebagai pengencer. Bahan dan alat. 1. Hemoglobinometer Sahli, terdiri atas : - Tabung Sahli berskala (% atau gr %) - Pipet Sahli 0.020 ml. (20 cmm) dan aspirator. - standar warna Sahli - Alat pengaduk

- Pengukur waktu (tidak selalu tersedia) 2. HCl 0.1 N 3. Aquadestilata 4. Jarum penusuk pembuluh darah (lanset, franke, atau lainnya). 5. Gunting (bila perlu) 6. Alkohol 70 % dan kapas Tata kerja - Isilah tabung Sahli dengan larutan HCl 0.1 N sampai angka 10 (garis paling bawah pada tabung) - Bersihkan tempat pengambilan darah dengan menggunakan kapas beralkohol dan biarkan kering. Bila daerahnya berbulu, misalnya telinga kelinci atau kaki anjing, gunting dahulu bulunya. - Tusuklah pembuluh darah dengan menggunakan franke/lancet isaplah darah dengan pipet sahli sampai batas 20 (0.02ml) perlahan-lahan. - Bersihkan ujung pipet dan segera masukkan darah ke dalam tabung Sahli. Tabung sahli diletakkan diantara kedua bagian standar warna dalam alat hemoglobinometer. - Biarkan selama 3 menit sampai terbentuk asam hematin yang berwarna coklat. - Dengan meggunakan pipet tetes, tambahkan ke dalam tabung setetes demi setetes aquadestilata sambil diaduk, sampai warna sama dengan warna standar. - Bacalah tinggi permukaan cairan pada tabung Sahli, dengan melihat skala jalur gr %, yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100ml darah. Jalur skala lainnya pada tabung Sahli kalau ada yang menunjukan % Hemoglobin terhadap nilai hemoglobin normal 15.6 gr %, atau nilai normal lainya yang tertera pada alat hemoglobinometer. Lembaran kerja Kadar hemoglobin : gr % Kadar hemoglobin : % dari nilai normal Atau = gr %

Pertanyaan 1. Apakah hasil yang anda dapatkan dari kedua cara pembacaan sama? mengapa? Jelaskan! 2. Bila tidak ada pipet Sahli di dalam alat hemoglobinometer, (kemungkinan sudah pecah), apakah dapat dipakai pipet buka Sahli yang volume 20 ml? Mengapa? Jelaskan? C. HEMATOKRIT (% VOLUME BDM) METODA MIKROHEMATOKRIT Tujuan Praktikum Menentukan nilai hematokrit (%volume eritrosit) di dalam darah dengan metoda mikrohematokrit Prinsip Darah yang tercampur dengan antikoagulan dipusing dengan alat centrifuge sehingga terbentuk lapisan-lapisan. Kolom atau lapisan yang terdiri atas butir-butir darah merah atau eritrosit diukur dan dinyatakan sebagai % volume dari keseluruhan darah. Bahan dan alat - Pipet mikrokapiler yang dilapisi heparin (heparinized microcapilary tube) - Alat pemusing (centrifuge) mikrokapiler - Alat untuk membaca hematokrit mikrokapiler (micro capilary reader) - Crestaseal (penyumbatan pipa kapiler ) atau microburner (api) - Perlengkapan untuk mengambil darah : jarum penusuk pembuluh darah atau lancet, alkohol 70%, kapas dan gunting bila perlu. Tata kerja - Bersihkan daerah pengambilan darah. - Tusuk pembuluh darah dan setelah darah keluar, tempelkan ujung mikrokapiler yang bertanda (merah atau biru) pada tetesan darah tadi. Biarkan darah mengalir sendiri mengisi 4/5 bagian pipa kapiler.

- Sumbat pipa ujung kapiler yang bertanda (tidak selalu bertanda ) dengan crestaseal atau bakar ujung pipa tersebut dengan hati-hati. - Tempatkan pipa kapiler dalam alat pemusing, bagian yang tersumbat ditempatkan menjauhi pusat alat pemusing. - Pusing dengan alat pemusing mikrokapiler (microcentrifuge) selama 5 menit dengan kecepatan 11.500-15.00 RPM atau 15 menit dengan kecepatan 2.500-4.000 RPM. - Setelah dipusing, terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri atas lapisan plasma yang jernih dibagian teratas, kemudian lapiasan putih abu-abu (buffy coat) ialah trombosit dan leukosit dan lapisan merah yang terdiri atas eritrosit. - Nilai Hematokrit ditentukan dengan mengukur % volume eritrosit (lapisan merah) dari darah dengan menggunakan alat baca mikrohematokrit (microcapilary hematoksit reader). - Ada beberapa macam alat untuk mengukurnya, yang sederhana cara memakainya adalah: a. Letakkan dasar lapisan merah pada pipa kapiler tepat pada garis (pipa tegak lurus) dan permukaan lapisan plasma (pertemuan antara plasma dan udara) memotong garis horizontal 100%. b. % Hematokrit dapat dibaca pada bagian kanan yang bertepatan dengan tinggi kolom/lapisan eritrosit dalam pipa kapiler. Pipa mikrokapier yang berlapis heparin setelah diisi darah dan di pusing dengan alat microcentrifuge terbentuk lapisan-lapisan sebagai berikut : Terbuka! Lapisan jernih : plasma Laisan putih abu-abu (buffy coat) : trombosit dan leukosit. Lapisan merah : eritrosit (BDM) Cresta seal

Gambar 25. Pipet mikrokapiler yang berlapis heparin D. MENGHITUNG JUMLAH BUTIR DARAH MERAH DAN JUMLAH BUTIR DARAH PUTIH Tujuan Praktikum 1. Menghitung jumlah butir darah merah (BDM, eritrosit) per mm 3 (cmm) 2. Menghitung jumlah butir darah putih (BDP, lekosit) per mm 3 (cmm) Prinsip Dengan menggunakan pipet eritrosit/lekosit, darah dicampur dengan larutan pengencer. Kemudian dengan menggunakan Hemositometer (kamar hitung), banyaknya butir darah per mm 3 dihitung di bawah mikroskop dan setelah dikoreksi terhadap faktor pengenceran, jumlah BDM/BDP per mm 3 darah dapat ditentukan. Bahan dan alat - Hemositometer Neubauer atau merk lainnya, yang terdiri atas : a. Kamar hitung dan kaca penutupnya. b. Pipet (pengencer) eritrosit, dengan ciri di dalamnya terdapat butiran berwarna merah dan skala pada pipet tersebut :0.5-1.0-101. c. Pipet (pengencer) lekosit, dengan ciri di dalamnya terdapat butiran berwarna putih, dan skala pada pipet ini :0.5-1.0-11. kedua pipet tersebut dilengkapi dengan aspirator. d. Mikroskop biasa, dengan objektif 10x dan 45x. Okuler : 10x Larutan pengencer (dapat dipilih) : Untuk eritrosit misalnya, larutan Hayem : Untuk lekosit pada mamalia, misalnya larutan Turk. Lekosit aves : modifikasi Rees dan Ecker (larutan BCB 0.3 %). e. Alat pengambil darah : lanset/jarum Franke : alkohol 70% kertas atau kain penyerap yang halus (kertas tissue): gunting kalau perlu. f. Cawan/mangkok kecil (2) untuk tempat larutan pengencer. g. Alat untuk menghitung (hand tally).

Tata kerja - Siapkan kamar hitung. Dengan hati-hati bersihkan dengan kain yang bersih dan lunak, juga siapkan mikroskop. - Periksa/amati kamar hitung di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x (objektif 10x dan okuler 10x), maka akan terlihat gambar kotak-kotak seperti contoh gambar 7. - Ukuran-ukuran kamar hitung sebagai berikut. a. Panjang seluruh kamar hitung : 3mm b. Lebar seluruh kamar hitung : 3mm c. Kamar hitung dibagi dalam 9 butir sangkar besar, yang masing-masing mempunyai luas 1mm 2. d. Empat bujur sangkar yang terletak di keempat sudut kamar hitung, masing-masing terdiri atas 16 buah bujur sangkar yang luasnya 1/16 mm 2. e. Satu dari 9 bujur sangkar yang besar, yang terletak ditengah-tengah, terdiri atas 25 buah bujur sangkar kecil (dibatasi oleh garis tebal). Setiap bujur sangkar yang kecil ini dibagi dalam 16 bujur sangkar yang lebih kecil lagi (terkecil), dengan ukuran luas(1/20 x 1/20) mm 2 = 1/400mm 2 f. Kedalaman kamar hitung (tinggi) ialah jarak antara dasar kamar hitung dan kaca penutupnya = 1/10 mm. Teknik menghitung a. Untuk menghitung butir darah putih digunakan 4 kotak yang terletak di keempat sudut kamar hitung (yang masing-masing terdiri atas 16 bujur sangkar, pada gambar diberi tanda huruf W). Satu kotak mempunyai luas 1mm 2 dan dalamnya 1/10 mm, jadi ruangan untuk menghitung jumlah butir darah putih seluruhnya mempunyai ukuran isi = (4x1x1/10)mm 3 = 4/10 mm 3.

Gambar 26. Hemositometer Neubauer. Dilihat dari atas dilihat dari samping (dengan kaca penutupnya) Kamar hitung Neubauer (dilihat di bawah mikroskop)

Kotak W untuk menghitung BDP : 4 buah Kotak R untuk menghitung BDM : 5 buah Gambar dikutip dari buku Brown, B.A :Hematology : Principles And Procedures) b. untuk menghitung butir darah merah digunakan 5 kotak kecil (R) yang terletak di bagian tengah kamar hitung, ialah 4 buah yang terletak di sudut, dan sebuah terletak di tengahtengah. Masing-masing kotak kecil ini terdiri atas 16 kotak dengan ukuran terkecil yang berukuran 1/20 mm x 1/20 mm = 1/400 mm2 luasnya, dan kedalamanya 1/10 mm. (ukuran ini yang biasanya tercantum pada alat Hemositometer). c. Satu kotak kecil mempunyai luas (16 x 1/400) mm 2 dan dalamnya 1/10 mm, sehingga jumlah isi ruangan yang dihitung eritrositnya = 5 x (16x1/400x1/10) mm 3 = 80/4000 mm 3 = 1/50 mm 3. d. Semua butir darah yang terletak di dalam kotak yang telah ditentukan dihitung jumlahnya. Bila ada butir-butir darah yang terletak pada garis-garis tepi bujur sangkar, maka yang dimasukkan dalam perhitungan ialah yang terletak pada dua buah garis (sisi) yang membentuk sebuah sudut, misalnya garis (sisi) atas dan samping kiri, dan ini harus konsisten. Lihatlah gambar di bawah.

Gambar 27. Panduan cara menghitung butir darah - Teknik mengisi kamar hitung Untuk menghitung butir darah merah (eritrosit) : a. Pasang aspirator pada ujung pipet eritrosit b. Setelah dibersihkan daerah tempat pengambilan darah, tusuk pembuluh darahnya. Darah yang pertama keluar dihapus dulu, dengan menggunakan aspirator pada pipet, isaplah darah yang keluar berikutnya, sampai batas angka 0.5 atau 1.0 pada pipet eritrosit. c. Bersihkanlah ujung pipet dengan kertas atau kain yang halus (kertas tissue) d. Dengan cepat dan hati-hati, isaplah larutan pengencer Hayem sampai tanda 101 yang tertera pada pipet. Harus diperhatikan pada saat mengisap darah atau larutan pengencer, tidak boleh ada gelembung udara. Bila hal ini terjadi, harus diulang, juga bila terdapat bekuan. Bila kelebihan sedikit larutan yang diisap, dengan hati-hati singgungkanlah ujung pipet pada kertas tissue. Jangan ditiup. e. Lepaskan aspirator dengan hati-hati dari pipetnya. Harus dijaga agar tidak ada cairan yang keluar dari pipet. f. Dengan menutup kedua ujung pipet dengan ibu jari dan jari telunjuk tangan kanan, kocoklah isi pipet dengan cara membuat gerakan angka (8) atau gerakan, agar yang tercampur hanyalah yang terdapat dibagian pipet yang membesar saja (1.0-101) g. Buang cairan pada ujung pipet yang tidak ikut terkocok.

h. Masukkan dengan hati-hati setetes cairan kedalam kamar hitung dengan cara menempelkan ujung pipet pada tempat pertemuan antara dasar kamar hitung dan kaca penutup. Jangan ditutup! i. Biarkan butir-butir darah yang ada di dalam kamar hitung mengendap. j. Hitung jumlah butir darah merah dengan menggunakan teknik yang telah dikemukakan tadi. Gambar 28. Pipet eritrosit dan aspiratornya (0.5-1-101) Gambar 29. Pipet leukosit dan aspiratornya (0.5-1-11) Pengencer darah didalam pipet eritrosit dan leukosit 0.5 0.5 Vol. Darah vol. Darah +99.5 vol. Lar +9.5 vol. Lar Pengencer pengencer 100x 20x Untuk eritrosit untuk leukosit

Teknik untuk menghitung jumlah butir darah putih (leukosit) sama dengan menghitung butir darah merah, perbedaanya terdapat pada macam pipet, larutan pengencer, dan ruang hitungnya. - Dengan pipet leukosit, darah diisap sampai tanda 0.5 atau sampai 1.0 - Kemudian larutan pengencer Turk diisap sampai tanda 11 pada ujung lain pipet ini. - Selanjutnya caranya sama dengan untuk BDM. Perhitungan : Untuk BDM : Volume ruangan kamar hitung yang digunakan 5 kotak R (lihat contoh gambar 14) = 5 x 16 x 1/4000mm3 = 1/50 mm3. bila jumlah BDM dalam ruangan tersebut = a butir, maka 1/50 mm 3 a butir 1 mm 3 a x 50 butir Faktor koreksi pengenceran. Darah 0.5, larutan pengencer sampai 101 dikurangi 1 bagian yang tidak ikut dicampur (dibuang), sehingga pengenceranya 200 x. Jadi : Jumlah butir darah merah per mm 3 darah = 200 x 50 x a butir = a x 10 4 butir. Untuk BDP : Volume ruangan kamar hitung yang digunakan dalam perhitungan BDP : 4 kotak besar (kotak W dalam gambar 14) = 4 x 1 mm2 x 1/10 mm = 4/10 mm3 Bila jumlah BDP dalam ruangan tersebut = b butir, maka 1 mm3 10/4 x b Faktor pengenceran. Darah 0.5 larutan pengencer sampai 11 dikurangi 1 bagian yang tidak ikut tercampur (dibuang), sehingga pengencerannya 20 x. Jadi : Jumlah BDP per mm 3 darah = 20 x 10/4 x b butir = b x 50 butir

Pertanyaan 1. Untuk Tujuan Praktikum apa dilakukan penghitungan jumlah butir darah merah per mm darah? dan jumlah butir darah putih? 2. Terangkan : a. apa yang dimaksud dengan MCV ; MCH ; MCHC. b. Bagaimana cara mendapatkan nilainya? c. Apa gunanya mengetahui nilai-nilai tersebut?