III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Bahan dan Peralatan Penelitian 3.1.1 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian terdiri dari bahan utama dan bahan tambahan. Bahan utama berupa daging sapi bagian sampil (chuck) dari sapi Peranakan Ongole jantan dengan jumlah daging yang diperlukan seberat 6 kg dan daun teh hijau kering merk Tong Tji sebanyak 720 gram. Bahan tambahan berupa garam, bawang putih, dan lada hitam. 3.1.2 Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Asam galat, untuk analisis kadar polifenol. 2. Aquadest, untuk pembuatan ekstrak teh hijau, analisis kadar polifenol, dan analisis kadar kolesterol. 3. Eter-alkohol, untuk analisis kadar kolesterol. 4. Kit diagnosa total kolesterol enzimatik (BIOLABO 80106), untuk analisis kadar kolesterol. Terdiri dari: a. Reagen analisis b. Kolesterol Standar (200mg/dL) 5. Metanol, untuk analisis kadar polifenol. 6. Na2CO3 7,5%, untuk analisis kadar polifenol. 7. Reagen Folin-Ciocalteu, untuk analisis kadar polifenol. 25
26 3.1.3 Peralatan Penelitian Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Gelas piala, untuk analisis kadar kolesterol. 2. Gelas ukur, untuk analisis kadar kolesterol dan polifenol. 3. Kertas label, untuk memberi tanda pada setiap perlakuan 4. Mesin vorteks, untuk analisis kadar kolesterol. 5. Oven, untuk pembuatan dendeng sapi. 6. Pipet ukur dan bulb pipet, untuk analisis kadar kolesterol dan analisis kadar polifenol. 7. Plastik PE, untuk merendam daging sapi. 8. Sentrifus, untuk analisis kadar kolesterol. 9. Spektrofotometer UV-Vis, untuk mengukur absorbansi sampel dendeng sapi dan standar kolesterol dan asam galat. 10. Tabung reaksi, untuk analisis kadar kolesterol dan analisis kadar polifenol 11. Timbangan analitik, untuk menimbang daun teh hijau kering dan sampel dendeng sapi. 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Prosedur Penelitian Penelitian dilakukan secara 2 tahap. Tahap pertama yaitu pembuatan ekstrak daun teh hijau yang digambarkan dengan diagram alir pada Ilustrasi 4. Tahap kedua adalah pembuatan dendeng sapi yang sebelumnya telah direndam dengan ekstrak teh hijau, lalu dilakukan analisis kadar kolesterol, kadar polifenol dan akseptabilitas dendeng sapi yang digambarkan dengan diagram alir pada Ilustrasi 5.
27 Daun teh hijau kering diseduh dengan aquadest panas (90-100 C) dengan perbandingan 6 : 100; dan 12:100 (gram:ml) Seduhan didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang Ekstrak disaring Eksrak Teh Hijau 6% Ekstrak Teh Hijau 12% Ilustrasi 4. Diagram Alir Pembuatan Ekstrak Teh Hijau (Modifikasi, dkk., 2014 dan Quelhas, dkk., 2010) 3.2.2 Peubah yang Diamati Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah: a. Kadar polifenol dendeng sapi b. Kadar kolesterol dendeng sapi c. Akseptabilitas dendeng sapi (aroma, rasa, tekstur, total penerimaan)
28 Daging sapi bagian sampil diiris dengan lebar 3 cm dan ketebalan 5 mm Daging direndam dengan berbagai konsentrasi ekstrak teh hijau dan waktu perendaman: Tanpa ekstrak selama 12 jam Tanpa ekstrak selama 24 jam Konsentrasi 6% selama 12 jam Konsentrasi 6% selama 24 jam Konsentrasi 12% selama 12 jam Konsentrasi 12% selama 24 jam Daging ditiriskan Daging dimasukan ke dalam oven dengan suhu 60 C selama 3 jam lalu dengan suhu 70 C selama 5 jam. Daging diberi bumbu: 2,5% garam 0,3% lada hitam 2% bawang putih Pengujian kadar polifenol Pengujian kadar kolesterol Pengujian organoleptik (aroma, rasa, tekstur, total penerimaan) Ilustrasi 5. Diagram Alir Penelitian Pembuatan Dendeng Sapi dan Pengujian Kadar Kolesterol, Polifenol, dan Total Penerimaan
29 3.2.3 Prosedur Analisis Kadar kolesterol dendeng sapi diukur berdasarkan metode oksidasi kolesterol enzimatis (CHOD-PAP). Pada metode ini, kolesterol dilepaskan dari lipoprotein oleh pelarut. Ester kolesterol dihidrolisis oleh kolesterol esterase (CE). Terjadi oksidasi enzimatis, dimana kolesterol bebas dioksidasi oleh kolesterol oksidase (CHO) sehingga menghasilkan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida bereaksi dengan enzim peroksidase membentuk quinonimine berwarna merah muda. Intensitas warna yang dihasilkan berbanding lurus dengan kasar kolesterol (Richmond, 1973). Prosedurnya yaitu sebanyak 10 ml eter-alkohol dipipetkan ke dalam tabung sentrifus, kemudian ditambahkan 1 gram dendeng yang sudah dihaluskan. Campuran divorteks selama 1 menit dan didiamkan selama 30 menit. Setelah 30 menit, campuran dididihkan di penangas air pada suhu 110ºC. Campuran disentrifugasi dengan sentrifus klinis selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan kemudian dituang ke dalam gelas piala sebagai ekstrak dendeng. Sebanyak 3 tabung reaksi disiapkan. Tabung 1 (sampel) berisi 1 L ekstrak dendeng + 1mL reagen. Tabung 2 (standar) berisi 1 standar kolesterol (200 mg/dl) + 1mL reagen. Tabung 3 (blanko) berisi 1 L aquades + 1mL reagen. Setiap tabung dikocok, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37ºC Absorban diukur pada panjang gelombang 500 nm menggunakan spektrofotometer UV-VIS dan dihitung konsentrasi kolesterolnya. Analisis kandungan polifenol menggunakan metode Folin-Ciocalteu yang absorbansinya diukur pada panjang gelombang 765 nm (Pourmorad, dkk., 2006).
30 Prinsip reaksi ini adalah berdasarkan reduksi reagen campuran fosfotungsticfosfomolibdat dengan gugus hidroksil fenolik yang menghasilkan produk berwarna biru, intensitas warna kemudian dikuantifikasi berdasarkan absorbansi dengan spektrofotometer (Vermerris dan Nicholson, 2006). Standar asam galat dibuat dengan variasi konsentrasi 0,1 1,6 ppm dan diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 765nm, setelah itu dibuat kurva standar dan persamaan liniernya. Prosedur yaitu sampel ditimbang sebanyak 0,5g lalu ditambahkan 5 gram metanol. Campuran dihomogenkan dengan sonikator selama 1 jam. Campuran disaring dan larutan hasil penyaringan sebagai ekstrak dendeng. Sebanyak 2 tabung reaksi disiapkan. Tabung 1 (sampel) berisi 50 L ekstrak dendeng + 2,5 ml reagen Folin + 2 ml Na2CO3 7,5%. Tabung 2 (blanko) berisi 50 + 2,5 ml reagen Folin + 2 ml Na2CO3 7,5%. Setiap tabung dikocok, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu 45ºC. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 765 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Kadar total polifenol pada larutan sampel dihitung menggunakan persamaan linier pada kurva standar. Perhitungan kadar total polifenol menggunakan rumus: Akseptabilitas dendeng sapi diukur dengan pengujian organoleptik metode hedonik menggunakan uji ranking skala Keeton (1983). Panelis dimintai keterangan mengenai aroma, rasa, tekstur, dan total penerimaan dari dendeng sapi yang dihasilkan dari pemberian perlakuan pada daging sapi (Lampiran 4).
31 Panelis yang digunakan adalah panelis agak terlatih mahasiswa Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, berjumlah 20 orang. Langkah pengujian akseptabilitas (Soekarto, 1985) yaitu menyiapkan sampel dan peralatan. Sampel diberi kode angka 3 digit. Menyiapkan lembar kuisioner pada setiap meja panelis. Mempersilahkan panelis memasuki ruangan pengujian. Memberikan penjelasan mengenai pelaksanaan penilaian uji organoleptik. Melaksanakan pengujian organoleptik. Mengumpulkan data hasil uji organoleptik dengan skala numerik. Data hasil uji organoleptik dengan skala numerik selanjutnya dilakukan analisis statistik. 3.2.4 Rancangan Percobaan Penelitian dilakukan secara eksperimen di laboratorium dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Tersarang dengan faktor konsentrasi terdiri atas 3 taraf dan faktor lama perendaman terdiri atas 2 taraf yang tersarang pada faktor konsentrasi. Setiap perlakuan dilakukan ulangan sebanyak 4 kali. Perlakuan dilakukan dengan tingkat penggunaan ekstrak teh hijau dan lama perendaman sebagai berikut: P0.12 : Perendaman tanpa ekstrak teh hijau selama 12 jam P0.24 : Perendaman tanpa ekstrak teh hijau selama 24 jam P6.12 : Perendaman dengan ekstrak teh hijau 6% selama 12 jam P6.24 : Perendaman dengan ekstrak teh hijau 6% selama 24 jam P12.12 : Perendaman dengan ekstrak teh hijau 12% selama 12 jam P12.24 : Perendaman dengan ekstrak teh hijau 12% selama 24 jam Model matematika dalam percobaan ini adalah sebagai berikut (Sastrosupadi, 2000):
32 Yijk = µ + i + j(i) + ijk Keterangan : Y ijk : Respon atau nilai pengamatan dari faktor konsentrasi taraf ke-i, faktor lama perendaman taraf ke-j, dan ulangan ke-k µ : Nilai tengah umum (rata-rata) i j(i) ijk : Pengaruh faktor konsentrasi taraf ke-i : Pengaruh faktor lama perendaman taraf ke-j pada faktor konsentrasi taraf ke-i : Galat percobaan dari faktor konsentrasi taraf ke-i, faktor lama perendaman taraf ke-j dan ulangan ke-k i : 0%, 6%, dan 12% j : 12 jam dan 24 jam k : 1,2,3,4 Hipotesis yang diuji : H0 : P0.12 = P0.24 = P6.12 = P6.24 = P12.12 = P12.24, Perlakuan tidak memberi pengaruh nyata H1 : P0.12 = P0.24 = P6.12 = P6.24 = P12.12 = P12.24, Perlakuan memberi pengaruh nyata Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan menggunakan tabel sidik ragam seperti yang tertera pada Tabel 2. Tabel 2. Sidik Ragam Kadar Kolesterol dan Polifenol Sumber Keragaman db JK KT Fhit Ftabel Konsentrasi a-1 = 2 JK JK /db KT / KTG Waktu Konsentrasi (i) Waktu*0% Waktu*6% Waktu*12% dalam a(b-1) = 3 (b-1) = 1 (b-1) = 1 (b-1) = 1 JK i JK 0% JK 6% JK 12% JK i / db i JK 0% / db 0% JK 6% / db 6% JK 12% / db 12% Galat ab(u-1) = 18 JKG JKG / dbg Total (abu-1) = 23 JKT Keterangan: db JK KT G : Derajat bebas : Jumlah Kuadrat : Kuadrat Tengah : Galat : Faktor konsentrasi : Faktor lama perendaman KT KT KT KT i / KTG 0% / KTG 6% / KTG 12% / KTG
33 Kaidah keputusan : Jika, 0,05 ; tidak berbeda nyata (non signifikan). Jika, F hit > F tabel 0,05 ; berbeda nyata (signifikan). Selanjutnya untuk mengetahui tingkat perbedaan setiap perlakuan penggunaan konsentrasi ekstrak teh hijau, diuji dengan menggunakan uji jarak berganda Duncan dengan rumus sebagai berikut (Gaspersz, 2006). LSR = SSR. Keterangan: KTG U LSR SSR d : Standar error (simpangan baku) : Kuadrat tengah galat : Ulangan : Least Significant Range : Studentized Significant Range : Selisih antar perlakuan Kaidah keputusan : Bila ;, maka tidak berbeda nyata, maka berbeda nyata Data hasil uji organoleptik dianalisis dengan uji Kruskal-Wallis. Rumus untuk uji Kruskal-Wallis sebagai berikut (Suliyanto, 2014): Keterangan : H R i n i k N : Nilai Kruskal-Wallis dari data perhitungan : Jumlah peringkat dari perlakuan ke-i : Banyaknya ulangan pada perlakuan ke-i : Banyaknya perlakuan (i=1,2,3,4,5,6) : Jumlah seluruh ulangan
34 Kaidah keputusan : Signifikasi nilai H menggunakan tabel Chi-kuadrat Jika, H 0,05(k-1) ; tidak berbeda nyata (non signifikan). Jika, H > 0,05(k-1) ; berbeda nyata (signifikan). 3.2.5 Pengacakan Percobaan Pengacakan dilakukan dengan menggunakan tabel angka acak (Gaspersz, 2006) dengan tahapannya yaitu pada penelitian ini terdapat 6 perlakuan dengan masing-masing perlakuan diulang sebanyak 4 kali sehingga tersedia 24 satuan percobaan. Letakkan ujung pensil pada tabel angka acak secara sembarang kemudian dibaca secara vertikal dengan mengambil tiga digit angka dari depan. Memilih 24 angka dalam susunan tiga digit. Angka-angka yang tertera disusun berdasarkan urutan dari angka yang terkecil hingga angka terbesar yang kemudian diberi ranking 1 sampai 24. Melalui prosedur pengacakan di atas maka dapat dibuatkan tabel pengacakan perlakuan yang disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Pengacakan Perlakuan 1 2 3 4 5 6 P0.24 P12.24 P12.12 P12.12 P6.12 P6.24 7 8 9 10 11 12 P6.12 P0.12 P6.24 P0.24 P6.24 P12.24 13 14 15 16 17 18 P0.24 P12.12 P6.12 P0.24 P0.12 P12.12 19 20 21 22 23 24 P0.12 P12.24 P12.24 P6.24 P6.12 P0.12 Keterangan : P 0.12 P 0.24 P 6.12 P 6.24 P 12.12 P 12.24 : Perendaman daging sapi tanpa ekstrak teh hijau selama 12 jam : Perendaman daging sapi tanpa ekstrak teh hijau selama 24 jam : Perendaman daging sapi dalam ekstrak teh hijau 6% selama 12 jam : Perendaman daging sapi dalam ekstrak teh hijau 6% selama 24 jam : Perendaman daging sapi dalam ekstrak teh hijau 12% selama 12 jam : Perendaman daging sapi dalam ekstrak teh hijau 12% selama 24 jam