BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Jenis penelitian ini adalah eksperimental, dengan rancangan One Group Pretest and Posttest Design untuk mengetahui efektifitas antosianin dan toksisitas (LD 50 ) kulit buah jamblang sebagai penurun low density lipoprotein pada tikus wistar yang hiperkolesterolemia. Penelitian ini menggunakan enam kelompok, yaitu dua kelompok kontrol dan empat kelompok eksperimental, dengan randomisasi sederhana. Pada penelitian terdapat pretest sebelum diberi perlakuan, dengan demikian hasil perlakuan dapat diketahui lebih akurat karena dapat membandingkan antara keadaan sebelum diberi perlakuan dan setelah perlakuan. 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Tempat Penelitian : Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Analis Kesehatan Sekolah Menengah Kejuruan Kesehatan Bali Medika Denpasar Waktu Penelitian : Penelitian ini sudah dilaksanakan pada bulan Mei sampai Agustus 2014 4.3 Ruang Lingkup Ruang lingkup penelitian ini adalah pengukuran kadar antosianin total dalam kulit buah jamblang dan pengujian efektifitas antosianin dalam kulit buah jamblang sebagai alternatif dalam penurunan LDL dibandingkan obat sistetis 29
30 (simvastatin) serta pengujian keamanan konsumsi dari antosianin dengan melakukan pengujian toksisitas antosioanin (LD50) 4.4 Penentuan Sumber Data 4.4.1. Populasi penelitian : Tikus jantan galur Wistar yang diperoleh dari Pet Shop di Pasar Burung Satria, Denpasar. 4.4.2. Sampel penelitian : Tiga puluh ekor tikus wistar jantan yang dibagi dalam enam kelompok, dan masing-masing kelompok terdiri atas lima ekor tikus wistar. Kriteria inklusi : tikus wistar jantan dengan kondisi sehat (aktif, tidak cacat), berat badan 150-250 gram dan usia 8 minggu. Kriteria ekslusi : bobot tikus menurun hingga berat badannya kurang dari 150 gram, tikus mati dalam masa penelitian, dan tikus mengalami diare selama penelitian berlangsung. 4.5 Variabel Penelitian 4.5.1 Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak antosianin yang diberikan pada sampel Definisi Operasional : Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak antosianin yang diberikan pada sampel. Ekstrak antosianin diberikan pada berbagai takaran 4.5.2 Variabel terikat Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar LDL (low density lipoprotein) pada sampel darah tikus wistar
31 Definisi Operasional : Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar LDL pada sampel darah tikus wistar. Kadar LDL diukur secara periodik dengan reagen Kit dyasis 4.5.3 Variabel pengganggu a. Aktivitas tikus Aktivitas tikus yang hiperaktif dapat menyebabkan penurunan palsu pada kadar LDL di dalam tubuh tikus. Sehingga untuk mengendalikannya penulis menyiapkan wadah sampel yg kecil (30 x 20 cm) untuk meminimalisir aktivitas sampel b. Pola konsumsi pakan Pola konsumsi makanan berpengaruh pada asupan antosianin yang masuk dalam tubuh sampel. Semakin banyak asupan yang dikonsumsi bersama dengan makanan maka semakin besar penurunan kadar LDL. Pengendalian yang bisa dilakukan oleh penulis adalah dengan memberikan jumlah asupan yang sama pada setiap sampel dan pemberian makanan pada jangka waktu yang telah ditentukan. c. Warna kulit buah jamblang Warna dari kulit buah jamblang sangat mempengaruhi kandungan antosianin tertinggi untuk digunakan dalam penelitian. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Leimena, 2008 kulit buah jamblang yang mempunyai warna ungu kehitaman memiliki kandungan antosianin tertinggi dibandingkan dengan warna buah yang lain
32 4.6 Bahan Penelitian 4.6.1 Bahan Penelitian Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah jamblang. Kulit buah jamblang dipisahkan dari daging dan bijinya sehingga diperoleh sampel kulit-daging buah, sedangkan kulit kulit buah jamblang dipisahkan dari daging buahnya dengan menggunakan pisau stainless steel sehingga diperoleh kulit buahnya saja. 4.6.2 Bahan Kimia (Reagensia) a. Bahan Ekstraksi : Etanol PA dan HCl 0,1% b. Bahan pengukuran HDL dan LDL : Reagen Kit Dyasis c. Bahan pengukuran SGOT, SGPT, Ureum, dan Kreatinin : Reagen Kit Thermo Scientific d. Bahan pengukuran total antosianin : KCl ph 1,0 dan Natrium Asetat Monohidrat ph 4,5 e. BAA (n-butanol-asam asetat-air dengan perbandingan 4:1:5) 4.7 Alat Penelitian Alat yang digunakan adalah pisau stainless steel, hand blender, penyaring, sentrifus, rotary vacuum evaporator, neraca analitik, penangas air, cawan porselin, plat silika gel, spektrofotometer VWR UV-1600PC, dan alat-alat gelas keperluan analisis. 4.8 Prosedur Penelitian 4.8.1 Ekstraksi antosianin Kulit buah jamblang yang masih segar sebanyak 2 kg diuapkan selama 2
33 menit dengan menggunakan uap panas untuk menginaktifkan enzim polifenol oksidase. Sampel yang diperoleh dimasukkan ke dalam kantong plastik dan disimpan dalam lemari pembeku untuk tahapan selanjutnya. Ekstraksi antosianin dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol asam (etanol + HCl 0,1%). Hal ini dikarenakan antosianin lebih stabil dalam suasana sedikit asam. Sampel sebanyak 2 kg dihancurkan dan dilarutkan dalam 0,1% HCl dalam etanol (500 ml) kemudian diekstrak dengan cara diaduk selama 60 menit pada suhu kamar. Larutan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm untuk memisahkan filtrat dan residu. Filtrat yang dihasilkan kemudian ditampung dalam erlenmeyer, sedangkan residunya diekstrak kembali dengan cara yang sama sampai didapat filtrat yang bening yang menandakan bahwa semua antosianin telah terekstrak. Ekstrak yang didapat kemudian diuapkan pelarutnya dengan menggunakan penyaring vakum pada suhu 35 o C sehingga dihasilkan ekstrak pekat (Leimena, 2008) 4.8.2 Karakterisasi antosianin Karakteristik antosianin pada kulit buah jamblang ditentukan dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS dan TLC (Thin Layer Chromatography). Analisis spektrofotometri didasarkan pada prosedur yang dilakukan oleh Harborne (1967) dan Francis (1982). Analisis ini dilakukan untuk mengetahui spektra/spektrum dan diketahui panjang gelombang maksimum dari komponen antosianin pada buah jamblang sehingga dapat diketahui karakteristiknya seperti ada tidaknya gugus asil (Harborne, 1967).
34 Pengukuran ini dilakukan pada ekstrak kulit buah jamblang menggunakan spektrofotometer VWR UV-1600PC pada panjang gelombang antara 200 700 nm. Data karakteristik dari panjang gelombang maksimum (spektra) yang diperoleh kemudian dicocokkan dengan tabel data panjang gelombang maksimum untuk beberapa antosianidin (Harborne, 1967). Analisis TLC didasarkan pada prosedur yang dilakukan oleh Hrazdina (1970) dengan modifikasi yaitu penggantian plat selulose dengan plat silika gel. Lempeng TLC yang digunakan pada penelitian ini terbuat dari silika gel, sedangkan eluennya adalah BAA (nbutanol-asam asetat-air dengan perbandingan 4:1:5). Sebelum digunakan, eluen ini dijenuhkan selama 1 jam. Sampel dispotkan pada lempeng TLC dengan jarak 1 cm dari bagian bawah lampeng TLC dan jarak antara masing-masing spot adalah 1 cm. Spot tersebut dibiarkan kering, kemudian dielusi dengan eluen BAA dalam chamber TLC hingga jarak eluen 0.5 cm dari bagian atas lempeng TLC. Lempeng tersebut kemudian dibiarkan kering dan dihitung nilai Rf-nya. 4.8.3 Pengukuran kadar antosianin total dalam ekstrak kulit buah jamblang Penentuan kandungan antosianin total dalam ekstrak kulit buah jamblang menggunakan metode perbedaan ph. Ekstrak kulit buah jamblang sebanyak 5 ml dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml. Dilarutkan dengan KCl ph 1,0 dan Natrium Asetat Monohidrat ph 4,5 sampai tanda batas. Kemudian diambil 1 ml dan dimasukkan dalam labu ukur 10 ml dan tambahkan buffer yang sama sampai tanda batas. Dilakukan inkubasi selama ± 35 menit Lalu larutan pada kondisi ph yang berbeda tersebut diukur serapannya menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm dan 700 nm. Kandungan antosianin total pada
35 ekstrak kulit buah jamblang dihitung menggunakan perhitungan dengan koefisien ekstingsi molar (ε) sebesar 26.900 (berdasarkan koefisien ekstingsi molar dari sianidin-3 glukosida) dan bobot molekul sebesar 449 sebagai berikut : (Widyawati, 2014) Keterangan : A : (A520 nm A700 nm)ph 1 (A520 nm A700 nm) ph 4,5 Ε : koefisien ekstingsi molar (26 900 L cm -1 ) MW : Bobot molekul ( 449 ) DF : Faktor pengenceran ( 5 ml / 0.05 ml ) l : Tebal kuvet (1 cm) (Lee, et al., 2005) Hasil penelitian pendahuluan menunjukkan kandungan antosianin dalam kulit buah jamblang kering yang berwarna ungu kehitam-hitaman adalah 821 mg/l. Hasil uji ini digunakan dalam penentuan dosis penggunaan pada sampel uji disesuaikan dengan pembanding antosianin dengan dosis serupa. 4.8.4 Penentuan dosis simvastatin Dosis simvastatin yang biasa digunakan oleh manusia adalah 1 x 5 mg/hari. Jadi dosis pemakaian untuk tikus wistar dapat dihitung dengan mengalikan dosis pemakaian pada manusia tersebut dengan faktor konversi manusia ke tikus wistar adalah 0,018 sehingga didapat dosis pemakaian untuk tikus wistar dengan berat badan 150 gram adalah sebagai berikut
36 5 mg x 0,018 = 0,09 / 150 g BB = 0,0006 g/bb = 0,6 mg/bb 4.8.5 Pembuatan makanan diet lemak tinggi (MDLT) MDLT dibuat dari campuran antara lemak sapi dan minyak (1: 5). MDLT ini nantinya akan diberikan pada semua kelompok uji kecuali kontrol negatif. Cara pembuatannya adalah timbang lemak 200 gram kemudian campurkan dalam minyak sebanyak 1000 gram sesuai dengan perbandingan (1:5) dengan bantuan pemanasan. MDLT diberikan secara oral sebanyak 2% BB. 4.8.6 Persiapan sampel penelitian dan pengukuran LDL dan HDL Penelitian menggunakan 30 ekor tikus wistar dan seluruh tikus mengalami masa adaptasi dan diberi pakan standar dan minuman yang sama selama 1 minggu. Tikus dibagi menjadi 2 kelompok, kelompok pertama sebagai kontrol negatif (Kontrol negatif) terdiri dari 5 ekor tikus diberi diet standar selama 7 minggu, kelompok kedua terdiri dari 25 tikus diberi diet standar selama empat minggu dan injeksi adrenalin 0,0045 mg/150 gram intravena pada hari kedelapan dilanjutkan dengan diet kuning telur setiap dua hari (intermiten) dan makanan diet lemak tinggi (MDLT) 2% BB dari hari kesembilan sampai hari ke-35. Pada hari ke-36 kadar kolesterol-ldl dan HDL serum tikus diperiksa dengan mengambil darah tikus dari pleksus retroorbitalis dan diukur dengan metode presipitasi secara spektrofotometri. Kelompok kedua dibagi menjadi 5 kelompok masing-masing terdiri dari 5
37 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol positif (Kontrol positif) yang diberi diet standar selama 3 minggu, kelompok perlakuan 1 (P1) yang diberi diet standar dan 23 g / 150 BB ekstrak kulit buah jamblang selama 3 minggu, kelompok perlakuan 2 (P2) yang diberi diet standar dan 46 g/ 150 BB ekstrak ekstrak kulit buah jamblang selama 3 minggu, kelompok perlakuan 3 (P3) yang diberi diet standar dan 69 g/ 150 BB ekstrak ekstrak kulit buah jamblang selama 3 minggu. Sebagai Pembanding adalah kelompok perlakuan 4 (P4) yang diberi diet standar dan simvastatin (0,09 g / 150 BB). Kadar kolesterol LDL dan HDL serum tikus Wistar diperoleh dengan mengambil darah tikus wistar dari pleksus retroorbitalis pada hari ke-56 dan diukur dengan metode presipitasi secara spektrofotometri di laboratorium Analis Kesehatan SMK Kesehatan Bali Medika Denpasar dinyatakan dengan satuan mg/dl. 4.8.7 Pengukuran tingkat keamanan konsumsi dalam 24 jam paparan Untuk penentuan tingkat keamanan konsumsi dalam 24 jam paparan hewan dikelompokkan secara acak menjadi 3 kelompok dan tiap kelompok terdiri dari 3 ekor tikus. Hewan-hewan dalam tiap kelompok diinjeksikan sediaan uji secara oral dengan dosis bertingkat 50 g, 100 g dan 150 g, Masing-masing menerima satu peringkat dosis. Dilakukan pengamatan kematian sampel dan penurunan aktivitas sampel selama 24 jam pemberian ekstrak antosianin. Selain itu dilakukan juga pengukuran SGOT dan SGPT sebagai tes fungsi hati serta Ureum dan Kreatinin sebagai tes fungsi ginjal.
38 4.9 Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif, selanjutnya untuk melihat pengaruh pemberian ektrak antosianin kulit buah jamblang sebelum dan setelah pemberian dilakukan uji paired samples T-test. Uji ini akan memberikan korelasi dan signifikasi pengaruh pemberian suatu perlakukan. Jika Sig < 0,05, maka terdapat hubungan yang signifikan antara sebelum dan sesudah perlakuan. Untuk menguji perbandingan efektifitas simvastatin dan ektrak antosianin kulit buah jamblang digunakan Uji Independent Samples T-test. Jika nilai sig <0,05, maka kesimpulannya ada perbedaan antara simvastatin dan ektrak antosianin kulit buah jamblang.