14 III OBJEK DAN METODE PENELITIAN 3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Objek Penelitian Objek penelitian ini berupa ovarium domba lokal umur <1 tahun 3 tahun yang diambil setelah melalui proses pemotongan di TPH Babakan Caringin Jatinangor. Ovarium domba diambil sesuai dengan kelompok umur yang sudah ditentukan. Bahan yang digunakan untuk membersihkan ovarium dari kotoran dan sebagai media koleksi oosit adalah NaCl 0,9% yang sebelumnya telah ditambahkan dengan antibiotik penicillin dan streptomycin. 3.1.2 Peralatan Penelitian (1) Peralatan Pengambilan Ovarium a. Pemanas, digunakan untuk memanaskan air didalam termos agar ovarium yang disimpan sesuai dengan suhu tubuh ternak. b. Gunting atau pisau, digunakan untuk memisahkan ovarium dari bagian tubuh domba yang telah dipotong. c. Neraca analitik, digunakan untuk menimbang bobot masing-masing ovarium sebelum dimasukkan ke dalam plastik. d. Jangka sorong, digunakan untuk mengukur diameter ovarium sebelum dimasukkan ke dalam plastik. e. Plastik, digunakan untuk menyimpan ovarium yang telah dipisahkan dari tubuh ternak ditambahkan dengan larutan NaCl 0,9% + penicillin dan streptomycin sebelum dimasukkan ke dalam termos. f. Termometer, digunakan untuk mengukur suhu air di dalam termos.
15 g. Label (penanda), digunakan untuk identifikasi ovarium dari masingmasing ternak betina yang dipotong. h. Termos, digunakan untuk menyimpan air serta ovarium yang sudah diletakkan ke dalam plastik selama proses transportasi dari TPH menuju Laboratorium. i. Saputangan karet, untuk menjaga ovarium agar tetap dalam keadaan steril. (2) Peralatan Untuk Mengukur Bobot dan Diameter Ovarium a. Jangka sorong, digunakan untuk mengukur diameter ovarium. b. Neraca analitik, digunakan untuk menimbang bobot ovarium. (3) Peralatan Koleksi Oosit a. Pinset, digunakan untuk menjepit dan menahan ovarium saat dilakukan slicing pada folikel. b. Pisau (penyayat), digunakan untuk mengoleksi oosit (metode slicing) c. Cawan Petri, digunakan sebagai tempat ovarium saat proses slicing. (4) Peralatan Evaluasi Oosit a. Cawan petri, digunakan sebagai wadah oosit setelah dislicing dan saat diidentifikasi secara mikroskopis. b. Student/research microscope stereo merk Yashima Tokyo No.870105 dengan menggunakan pembesaran 6 X 10, digunakan untuk melihat dan menghitung jumlah oosit yang dihasilkan.
16 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Prosedur Penentuan Umur Domba Pada penelitian ini dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan umur ternak tersebut yakni domba lokal umur (< 1 tahun), (1-2 tahun), dan (> 2 tahun). Guna menduga umur ternak domba berdasarkan gigi seri harus dilakukan dengan cara membuka mulut domba kemudian melihat berapa jumlah gigi seri yang tumbuh. Pendugaan umur berdasarkan gigi seri yaitu sebagai berikut: (1) Umur ternak kurang dari 1 tahun jumlah gigi seri tetap belum ada. Namun memiliki gigi susu. (2) Sepasang gigi seri susu sentral digantikan oleh sepasang gigi seri permanen sentral, kambing berumur 1-1,5 tahun; (3) Sepasang gigi seri susu lateral digantikan sepasang gigi seri permanen lateral, kambing berumur 1,5-2,5 tahun; (4) Sepasang gigi seri susu intermedial digantikan sepasang gigi seri permanen intermedial, kambing berumur 2,5-3,5 tahun; (5) Sepasang gigi seri susu sudut digantikan sepasang gigi seri permanen sudut, kambing berumur 3,5-4 tahun (Frandson, 1993). Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada (Ilustrasi 1). Ilustrasi 1. Pendugaan umur ternak domba berdasarkan pergantian gigi seri
17 3.2.2 Prosedur Pengambilan Ovarium Ovarium diambil dari ternak yang telah di potong dalam keadaan segar kemudian dikelompokan berdasarkan umur (< 1 tahun) (1-2 Tahun), dan (> 2 tahun). Ovarium dibilas dengan NaCl Fisiologis 0,9% yang sebelumnya telah ditambahkan dengan penicillin G (100 IU/ml) dan streptomycin sulfate (0,1 mg/ml) dan dimasukkan kedalam plastik yang berisi media yang sama yang sudah diberi label (penanda). kemudian disimpan dalam termos dengan temperatur yang dipertahankan pada suhu 35 O - 37 O C untuk selanjutnya dibawa ke laboratorium (Budiyanto dkk, 2013). Ovarium dibawa dari TPH ke laboratorium dalam waktu tidak lebih dari 3 jam (Adifa dkk, 2010). 1.2.3 Prosedur Pengukuran Bobot dan Diameter Ovarium. Menghitung bobot ovarium menggunakan neraca analitik sedangkan pengukuran diameter ovarium menggunakan jangka sorong. Perhitungan bobot dan ukuran ovarium di Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. 3.2.4 Prosedur Koleksi Oosit Mengoleksi oosit dengan metode slicing menggunakan pisau dan pinset sebagai alat untuk menyayat folikel. Penyayatan dilakukan secara hati-hati dan arah garis sayatan yang teratur. Hal ini untuk meminimalisir kerusakan yang terjadi pada oosit akibat sayatan. 3.2.5 Prosedur Evaluasi Kualitas Oosit Oosit yang telah dikoleksi, kemudian diseleksi menjadi 4 kelompok yaitu kelompok A, B, C, dan D berdasarkan lapisan sel kumulus dan gambaran sitoplasmanya (Gordon, 2003). Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada (Ilustrasi 2). Oosit dikelompokkan ke dalam kelompok A jika dilapisi oleh lebih dari lima
18 lapis sel kumulus dengan sitoplasma yang homogen dan berwarna hitam. Kelompok B adalah oosit yang dikelilingi oleh kurang dari lima lapis sel kumulus dengan sitoplasma yang homogen dan berwarna hitam. Kelompok C adalah oosit mempunyai sedikit kumulus dengan sitoplasma yang sudah tidak homogen. Kelompok D adalah oosit yang mempunyai sitoplasma transparan, zona pelusida terlihat dilapisi oleh separuh atau tidak ada, dan lapis sel kumulus hampir hilang atau hilang seluruhnya. Ilustrasi 2. Morfologi kualitas oosit A, B, C dan D (Gordon, 2003). 1.2.6 Perlakuan Penelitian Perlakuan yang diberikan pada penelitian ini adalah umur domba yang terdiri dari : a. Domba lokal umur < 1 tahun (P1). b. Domba lokal umur 1-2 tahun (P2). c. Domba lokal umur > 2 tahun (P3).
19 1.2.7 Parameter yang Diamati a. Bobot ovarium yang diukur menggunakan neraca analitik yang dikelompokan berdasarkan umur ternak yang sudah ditentukan. b. Diameter ovarium yang diukur menggunakan jangka sorong yang dikelompokan berdasarkan umur ternak yang sudah ditentukan. c. Kualitas oosit dilihat berdasarkan lapisan sel kumulus oophorus dan gambaran sitoplasma sesuai dengan umur ternak yang sudah ditentukan. 1.2.8 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan ulangan sebanyak enam kali. Setiap ulangan terdiri dari satu ekor domba (dua ovarium). (1) Bobot dan Diameter Ovarium Data bobot dan ukuran ovarium dianalisis menggunakan tabel sidik ragam (uji F). Model matematika yang digunakan sebagai berikut : Y ij = µ + α i + ε ij Keterangan : Y ij = Respon terhadap perlakuan ke-i ulangan ke-j µ = Nilai tengah / rata-rata umum α i ε ij i j = Pengaruh perlakuan ke-i = Pengaruh galat pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j = 1, 2, 3 (jumlah perlakuan) = 1, 2, 3, 4, 5, 6 (jumlah ulangan). Asumsi ε ij : 1. Nilai ij menyebar normal satu sama lain
20 2. Nilai harapan dari ij = 0 2 2 3. Ragam dari ij = Jadi, ij NID (0, ) Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan metode sidik ragam. Hipotesis yang akan diuji adalah : H 0 : H 1 : (Umur tidak berpengaruh pada bobot dan ukuran ovarium) (Umur berpengaruh pada bobot ovarium dan jumlah sel telur) Tabel 1. Analisis Ragam Sumber Keragaman Db JK KT F hit F tabel 0,05 Perlakuan (P-1) = 2 JKP KTP KTP/KTG F tabel Galat P(U-1)= 15 JKG KTG Total (PU-1)= 17 JKT Sumber : (Gasperz, 1995) Keterangan : Db JK KT = Derajat bebas = Jumlah kuadrat = Kuadrat tengah Kaidah keputusan : 1. Jika F hitung F tabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H 0 dan tolak H 1. 2. Jika F hitung > F tabel 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H 0 dan terima H 1. Apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata, maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan Uji Duncan dengan rumus : LSR SSR S X ; KT galat r S r 2 S y
21 Keterangan : S x r = Standard error = Ulangan KTG = Kuadrat Tengah Galat LSR SSR = Least Significant Range test = Studentized Significant Range Kaidah keputusan : Selisih antar perlakuan (d) dibandingkan dengan LSR 1. d LSR, maka tidak berbeda nyata. 2. d > LSR, maka berbeda nyata. (2) Kualitas Oosit Data rataan jumlah kualitas oosit kriteria A, B, C, dan D yang telah didapat dalam bentuk persentase sebelumnya perlu ditranformasi terlebih dahulu ke dalam bentuk Transformasi Akar Kuadrat agar proses pengujian dapat mendekati kesahihan saat pengujian statistik (Gaspersz, 1995). Rumus transformasi akar kuadrat sebagai berikut : (Y + 1/2 ) 1/2 Analisis untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap seluruh kriteria kualitas oosit setelah data ditransformasi, salanjutnya pengujian statistik menggunakan Uji Khi Kuadrat dengan model matematika sebagai berikut : Keterangan : = Frekuensi pengamatan (observasi) ke-i
22 = Frekuensi yang diharapkan mengikuti hipotesis yang dirumuskan (frekuensi harapan ke-i). Banyak data yang diharapkan mengikuti hipotesis yang dirumuskan dinyatakan dengan didapatkan dari rumus sebagai berikut : Keterangan : = Total frekuensi pengamatan pada baris ke-i dalam tabel kontingensi berukuran b x k. = Total frekuensi pengamatan pada kolom ke-j. T = Total seluruh frekuensi pengamatan. Penelitian ini bertujuan untuk memberikan informasi ilmiah kepada para peneliti sebelum melakukan penelitian IVF yang dapat dilakukan hanya dengan menggunakan kualitas oosit A dan B. Oleh karena itu, untuk mengetahui pengaruh dari ketiga perlakuan terhadap kualitas oosit A dan B dapat dihitung menggunakan analisis ragam. Hipotesis yang akan diuji melalui percobaan ini adalah : Ho : P 1 = P 2 = P 3, artinya tidak ada pengaruh perlakuan waktu preservasi ovarium terhadap kualitas oosit domba lokal. H 1 : P 1 P 2 P 3, artinya ada pengaruh minimal satu perlakuan waktu preservasi ovarium terhadap kualitas oosit domba lokal. Kaidah Keputusan:
23 1. Jika F hitung F tabel 0,05 artinya perlakuan tidak berbeda nyata (non significant), maka terima H 0 dan tolak H 1. 2. Jika F hitung > F tabel 0,05 artinya perlakuan berbeda nyata (significant), maka tolak H 0 dan terima H 1.