BAHAN DAN METODE Alat-alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah peralatan gelas, neraca analitik, pembakar Bunsen, rangkaian alat distilasi uap, kolom kromatografi, pipa kapiler, GC-MS, alat bedah, rangkaian alat inhalasi. Bahan-bahan yang digunakan adalah rimpang kencur, akuades, n-heksana, metanol, aseton, kloroform, dietil eter, etil asetat, silika gel, batu didih, pakan standar tikus, pakan kolesterol tinggi tikus, larutan pereaksi kolesterol, larutan pereaksi trigliserida. Metode Metode penelitian yang dilakukan mengikuti Gambar 1: Gambar 1. Alur penelitian
14 Pada tahap preparasi sampel, sampel kencur segar yang berusia sekitar 1.0-1.5 tahun diperoleh dari pasar induk Kramat Djati. Sampel dideterminasi di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor (Lampiran 1), diuji kadar air, dan kadar abu. Isolasi minyak atsiri kencur dilakukan dengan menggunakan destilasi. Minyak atsiri yang diperoleh disimpan dalam botol tertutup. Untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam destilat minyak atsiri kencur, terlebih dahulu dilakukan penentuan eluen terbaik menggunakan KLT. Selanjutnya fraksinasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom. Fraksi-fraksi yang telah diperoleh dianalisis jumlah nodanya. Fraksi dengan rendemen terbanyak, fraksi murni, dan distilat minyak atsiri kencur dianalisis menggunakan GC-MS untuk menentukan kandungan senyawanya. Ketiga sampel ini disimpan di dalam botol untuk kemudian diujikan pada hewan uji untuk mengetahui potensinya sebagai pelangsing atau penurun kolesterol aromaterapi. Metode analisis minyak atsiri yang berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi pada hewan uji digambarkan dalam Gambar 2. Gambar 2. Metode analisis minyak atsiri yang berpotensi sebagai pelangsing aromaterapi pada hewan uji
15 Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague-dawley (Yamamoto et al. 2000). Tikus yang digunakan sebanyak 40 ekor berusia 8 minggu dengan bobot badan 140-160 gram. Tikus dikelompokkan menjadi 5 kelompok. Setiap kelompok berjumlah 8 ekor yang ditempatkan di dalam kotak plastik bertutup kawat yang berisi 4 ekor tikus untuk setiap kotak. Jadi setiap kelompok ditempatkan dalam 2 kotak. Adapun penggolongan kelompoknya yaitu kelompok kontrol normal, kontrol negatif, atsiri kasar, Fraksi 2, dan kristal. Kelompok kontrol normal merupakan kelompok yang diberi pakan standar dan tidak diinhalasi. Kelompok kontrol negatif merupakan kelompok yang diberi pakan kolesterol tinggi dan tidak diinhalasi. Kelompok atsiri kasar diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi minyak atsiri kasar hasil destilasi uap dari rimpang kencur. Kelompok Fraksi 2 diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi menggunakan Fraksi 2 yang merupakan Fraksi dengan rendemen terbanyak. Kelompok kristal diberi pakan kolesterol tinggi dan diinhalasi menggunakan Fraksi senyawa murni.. Masa perlakuan dilakukan selama 5 minggu. Pemberian pakan dilakukan setiap hari, sehingga bobot pakan ditimbang setiap hari. Bobot badan tikus ditimbang setiap 1 minggu sekali. Pada minggu ke-5, setelah perlakuan selesai, dilakukan analisis secara fisik meliputi parameter persentase kenaikan bobot badan, bobot lemak dan hati. Adapun analisis uji darah meliputi kadar kolesterol, trigliserida dan HDL darah hewan uji. Metode analisis darah Metode analisis darah diawali dengan pengumpulan darah pada minggu ke- 5 setelah masa perlakuan. Darah diambil di bagian ekor hewan uji. Darah disentrifuga kemudian dipisahkan serum darahnya (bagian cairan jernih) dan disimpan dengan baik di lemari pendingin. Uji analisis darah yang dilakukan adalah analisis profil lipid meliputi pengukuran kadar kolesterol, kadar trigliserida, kadar high density lipoprotein (HDL). Berikut adalah cara kerja analisis profil lipid yang dilakukan di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) IPB:
16 1. Pengukuran kadar kolesterol total Serum darah sebanyak 0,01 ml dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan pereaksi kolesterol sebanyak 1 ml. Serapannya diukur pada panjang gelombang 500 nm terhadap blanko. Sebagai blanko digunakan pereaksi kolesterol 1 ml dan akuades 0,01 ml. Pengukuran serapan standar sama dengan pengukuran serapan sampel, tetapi serum darah diganti dengan standar kolesterol. Kadar kolesterol total dihitung menggunakan rumus: Keterangan : C = kadar kolesterol (mg/dl) A = serapan C Standar = kadar kolesterol standar Larutan pereaksi kolesterol dari PT. Rajawali Nusindo terdiri dari buffer ph 6.5, fenol, 4-aminofenazon, kolesterol esterase, kolesterol oksidase, peroksidase, sodium azida, standar kolesterol. 2. Pengukuran Kadar Trigliserida Serum darah sebanyak 0,01 ml dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan pereaksi trigliserida sebanyak 1 ml. Serapannya diukur pada panjang gelombang 500 nm terhadap blanko. Sebagai blanko digunakan pereaksi trigliserida 1 ml dan akuades 0,01 ml. Pengukuran serapan standar sama dengan pengukuran serapan sampel, tetapi serum darah diganti dengan standar trigliserida. Kadar trigliserida total dihitung menggunakan rumus: Keterangan : C = kadar trigliserida (mg/dl) A = serapan C Standar = kadar trigliserida standar Larutan pereaksi trigliserida dari PT. Rajawali Nusindo terdiri dari buffer ph 7.5, 4-klorofenol, gliserolkinase, peroksidase, lipase, ATP, 4- aminoantipirin, ion magnesium, gliserol-3-fosfat oksidase, standar trigliserida.
17 3. Pengukuran kadar HDL Serum darah sebanyak 0,02 ml dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan pengendap kemudian disentrifuga. Pisahkan supernatannya sebanyak 0,01 ml, kemudian ditambahkan larutan pereaksi kolesterol sebanyak 1 ml ke dalam supernatan. Serapannya diukur pada panjang gelombang 500 nm terhadap blanko. Sebagai blanko digunakan pereaksi kolesterol 1 ml dan akuades 0,01 ml. Kadar HDL dihitung menggunakan rumus: Keterangan : C = kadar HDL (mg/dl) A = serapan C Standar = kadar kolesterol standar Metode analisis bobot hati dan bobot deposit lemak pada hewan uji Metode analisis bobot hati dan bobot deposit lemak dilakukan pada minggu ke-5 setelah masa perlakuan. Masing-masing tikus dari setiap kelompok perlakuan dikeluarkan hati dan deposit lemaknya. Kemudian ditimbang bobot hati dan deposit lemaknya. Adapun lemak yang diambil adalah lemak pada perut bagian bawah, dan lemak yang membungkus organ di bagian perut. Metode analisis data Data yang diperoleh dari percobaan akan dianalisis dengan metode rancangan acak lengkap (RAL) dan ANOVA (analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95% (taraf α 0.05). Nilai P<0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata terhadap respon yang diukur. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan. Semua data ini dianalisis dengan program SPSS 16.