III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2011 sampai dengan bulan Februari 2012, bertempat di Laboratorium Pengawasan Mutu Hasil Pertanian Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Lampung dan Laboratorium Pengawasan Mutu Hasil Pertanian Politeknik Negeri Lampung. B. Bahan dan Alat Bahan baku utama yang digunakan adalah ubi jalar ungu yang dibeli di Pasar Tamin Bandar Lampung. Bahan tambahan yang digunakan adalah garam merek Refina dan gula putih merek Gulaku. Bahan kimia yang digunakan adalah aquades, garam NaCl untuk larutan pengencer, NaOH 0,1 N untuk titrasi, larutan buffer asam sitrat dibasic sodium phosphate ph 3 untuk penentuan intensitas warna, larutan buffer ph 4,5 dengan CH 3 CO 2 Na.3H 2 O, HCl pekat, akuades, larutan buffer ph 1,0 dengan KCl untuk penentuan total antosianin, aquades, media MRS agar, CaCO 3 untuk analisis total BAL dan bahan-bahan lain. Peralatan yang digunakan antara lain pisau, tabung reaksi, erlenmeyer, labu ukur, cawan petri, talenan, colony counter (Stuart Scientific), pipet, blender (PGW- 87407, philips) autoklav (Witeclave Daihan Scientific 1 atm.), ph-meter (PT-140
22 Micro 500, Palintest-UK), timbangan, hot plate, buret, botol berukuran 150 ml, Spektrofotometer (UV1901PC, Pheinik or Neutral) dan alat-alat lain. C. Metode Penelitian Rancangan Percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah Faktorial dalam Rancangan Acak Kelompok Lengkap (RAKL) dengan dua faktor dan tiga ulangan. Faktor pertama adalah konsentrasi garam (G) yang terdiri dari empat taraf, yaitu 3%, 6%, 9%, dan 12%. Faktor kedua adalah lama fermentasi (H) yang terdiri dari lima taraf, yaitu 0 hari, 3 hari, 6 hari, 9 hari, dan 12 hari. Satu unit percobaan menggunakan volume larutan garam sebanyak 110 ml dan ubi sebanyak 40 gram. Pengamatan dilakukan terhadap intensitas warna, total antosianin, total BAL, ph dan pengamatan sensori terhadap degradasi perubahan warna pikel dengan parameter warna antosianin pada berbagai tingkat ph. Data yang diperoleh diuji kesamaan ragamnya dengan uji Bartlett dan kemenambahan model diuji dengan uji Tuckey. Analisis sidik ragam digunakan untuk mendapatkan penduga ragam galat dan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan antar perlakuan. Data intensitas warna, total antosianin, total BAL, ph dan total asam, kemudian diolah lebih lanjut dengan uji Perbandingan Ortogonal dan Polinomial Ortogonal pada taraf nyata 1% dan 5%.
23 D. Pelaksanaan Penelitian 1. Pembuatan larutan garam Pembuatan larutan garam dilakukan menurut Rini (2009, dengan modifikasi). Garam ditimbang sebanyak 7,5; 15,0; 22,5 dan 30,0 g atau masing-masing setara dengan 3, 6, 9 dan 12% (b/v) dan penambahan gula sebanyak 2,5 g atau setara 1% (b/v) untuk setiap konsentrasi garam, lalu ditambahkan aquades hingga mencapai batas (tera) 250 ml dalam Erlenmeyer 250 ml. Lalu setiap tiga Erlenmeyer dipanaskan di dalam microwave oven selama 9 menit (suhu 67,5 o C), didiamkan 10 menit dalam wadah berisi air hingga suhunya mencapai 35 o C. Satu Erlenmeyer 250 ml berisi larutan garam dapat digunakan untuk 2 botol berukuran 150 ml. (Gambar 5). Garam ditimbang 3%,6%,9% dan 12% dari volume aquades yang digunakan (250 ml) Ditambahkan gula sebanyak 1% untuk setiap konsentrasi garam Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 ml dan ditambahkan aquades hingga tanda tera Tiga Erlenmeyer larutan garam dipanaskan di dalam microwave oven selama 9 menit (suhu ± 67,5 o C) Diamkan dalam wadah berisi air selama 10 menit hingga suhunya mencapai 35 o C Larutan garam siap digunakan Gambar 5. Diagram alir pembuatan larutan garam (Sumber : Rini, 2009)
24 2. Proses pembuatan pikel ubi jalar ungu Pembuatan pikel ubi jalar ungu mengikuti prosedur Rini (2009, dengan modifikasi). Ubi jalar dikupas kulitnya, dipotong dadu (1x1x1cm). Sebanyak 40 gr dimasukkan ke dalam botol 150 ml yang telah disterilisasi, lalu ditambah larutan garam yang telah disiapkan. Perbandingan ubi jalar ungu dan larutan garam adalah 40 g ubi di dalam 110 ml larutan garam. Sebanyak 5 botol berisi potongan ubi dan larutan garam dimasukkan ke dalam microwave oven selama 10 menit hingga suhu akhir mencapai 71-72 o C. Botol-botol berisi sampel tersebut ditutup rapat saat masih panas dan difermentasi pada suhu ruang selama 12 hari. Lalu dilakukan pengamatan fisikokimia dan mikrobiologi pada hari ke 0, 3, 6, 9, dan 12 (Gambar 6). Ubi jalar dicuci bersih dengan kulitnya Larutan garam Dikupas kulitnya, dipotong dadu (1x1x1cm) dan dicuci Ditimbang sebanyak 40 g untuk tiap botol Dimasukkan dalam botol bersih, steril, dan kering (ubi : larutan garam = 40g:110mL 6 Botol dimasukkan ke dalam microwave oven selama 10 menit Botol ditutup rapat saat panas Difermentasi selama 12 hari Pengamatan setiap 3 hari meliputi warna, total antosianin, ph dan total asam, total BAL Gambar 6. Diagram alir pembuatan pikel ubi jalar (Sumber : Rini, 2009)
25 E. Pengamatan 1. ph dan Total Asam Pengamatan nilai ph dan total asam tertitrasi dilakukan dengan menggunakan ph meter. Pikel sebanyak enam potongan ubi dan cairannya sebanyak 30 ml diblender. Kemudian disaring dengan kapas hingga didapat ekstraknya. Ekstrak tersebut lalu diukur ph nya dengan ph meter yang telah dikalibrasi. Untuk mengukur total asam, ekstrak tersebut di titrasi dengan NaOH 0,1 N hingga ph nya mencapai 8,0 yang merupakan ph akhir titrasi. Perhitungan kadar asam sebagai persentase asam laktat menggunakan rumus : Total asam (%) = ml NaOH x N NaOH x BM gram sampel BM = Berat molekul asam laktat = 90 2. Total Bakteri Asam Laktat Pengamatan total BAL didasarkan pada metode Fardiaz, (1989) dan modifikasi tambahan. Sebanyak satu ml cairan pikel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan pengencer (larutan garam fisiologis 0,85%) sebanyak 9 ml. Dengan cara ini didapat pengencean 10-1 kemudian dilakukan pengenceran sampai 10-2. Dari pengenceran 10-2 dan sampel tanpa pengenceran diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dituangkan media agar steril yang telah dipersiapkan sebelumnya pada suhu kira-kira 45 o C sebanyak 15 ml. Media yang digunakan terbuat dari MRS Agar (de Mann Rogosa Sharp) dan 1% CaCO 3. Segera setelah penuangan media, cawan petri digerakkan melingkar agar sel-sel mikroba merata. Apabila media sudah memadat, cawan petri diinkubasi dengan
26 posisi terbalik. Inkubasi dilakukan selama 2 hari. Jumlah mikroba dihitung (skala 30 sampai dengan 300 koloni). Koloni dengan zona bening dihitung sebagai BAL. Pengenceran yang dilakukan untuk fermentasi hari ke 3 dilihat dari koloni total BAL pada hari ke 0, untuk fermentasi hari ke 6 dilihat dari koloni total BAL pada hari ke 3, dan seterusnya. Total bakteri asam laktat = Jumlah koloni terhitung x Faktor 1 pengenceran 3. Analisis antosianin (AOAC. 2006) Kandungan antosianin dianalisis dengan metode perbedaan ph seperti yang dilakukan oleh Wrolstad (Awika et al., 2004). Prinsip metode ini adalah antosianin mengalami perubahan intensitas warna berdasarkan perubahan ph. Pada kondisi ph satu antosianin berada dalam bentuk oxonium atau flavylium yang memiliki intensitas warna yang kuat, sedangkan pada kondisi ph 4,5 antosianin dalam bentuk carbinol yang tidak berwarna. Peneraan dilakukan pada λ max 513 nm dan λ 700 nm sebagai koreksi adanya haze. Perbedaan absorbansi ini proporsional dengan kandungan antosianin dalam bahan. Kandungan antosianin kemudian dihitung dengan mempergunakan persamaan. Karena identitas dari senyawa antosianin tidak diketahui, maka koefisien ekstingsi molar dapat dinyatakan sebagai sianidin-3 glikosida yang merupakan antosianin yang paling banyak dijumpai di alam (Fardias, 1989). Hasil akhir perhitungan ini dinyatakan dalam mg/l. A Kandungan antosianin (mg/l) = ---------- x MW x DF (ε x I)
27 Keterangan : A : (A513 A 700)pH 1 (A 513 A 700)pH 4,5] MW : Berat molekul Sianidin-3-glukosida = 449,2g/mol DF : Dilution factor (Faktor Pengenceran) ε : Koefisien ekstingsi molar sianidin 3-glikosida = 29600L/(mol.cm) I : Tebal kuvet (1 cm) (Lee et al., 2005) 6,4 ml buffer (ph 1) 0,1 ml sampel 0,1 ml sampel Pencampuran Pencampuran 6,4 ml buffer (ph 4.5) Peneraan pada λ 513 dan λ 700 Kandungan antosianin Gambar 7. Skema analisis antosianin (Sumber : Ramadiyanti et al., 2010) 4. Intensitas Warna (FAO, 1984) a. Larutan buffer asam sitrat dibasic sodium phosphate ph 3 disiapkan sebanyak 200 ml dengan cara : 159 ml larutan asam sitrat 2,1 % dicampurkan dengan 41 ml larutan dibasic sodium phosphate 0,16 %. Kemudian ph diatur hingga ph 3 dengan menggunakan larutan asam sitrat atau larutan dibasic sodium phosphate. b. Panjang gelombang maksimum dari larutan diukur dengan cara sejumlah 20 ml sampel cairan pikel, kemudian diencerkan dalam labu ukur sampai 25 ml
28 menggunakan larutan buffer asam sitrat - dibasic sodium phosphate ph 3, kemudian diukur absorbansinya sehingga absorbansi yang terukur berada pada 0,2 0,7. Jika absorbansi melebihi 0,7 maka dilakukan pengenceran kembali sampai absorbansi yang terukur antara 0,2-0,7. Larutan buffer asam sitrat - dibasic sodium phosphate ph 3 digunakan sebagai blankonya. c. Penentuan intensitas warna diukur dengan rumus : Intensitas warna = A x V (ml) Berat sampel Keterangan: A = Nilai Absorbansi V = Volume pengenceran (ml) Berat sampel = 1ml 5. Uji Sensori (Warna) Penilaian sensori warna dilakukan setiap 3 hari dengan cara panelis diminta membandingkan warna cairan pikel ubi jalar ungu dengan parameter warna antosianin pada berbagai tingkat ph sebagai pembanding. Pada penelitian ini pengujian dilakukan oleh 15 mahasiswa sebagai panelis terhadap warna. Contoh kuesioner yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 7.
29 Tabel 7. Contoh kuesioner yang digunakan QUESIONER WARNA PIKEL UBI JALAR UNGU Nama panelis :... Jenis kelamin :... Tanggal :... Dihadapan saudara disajikan sampel pikel ubi jalar ungu yang diberi kode acak. Anda diminta untuk memberikan penilaian terhadap sensori warna dengan cara memberi skor dengan membanbdingkan dengan standar warna dengan skor dari 1 sampai 8 dibawah ini. Tabel quesioner penilaian skoring warana Sampel 123 735 299 450 321 Skor