MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Lokasi penelitian bertempat di Laboratorium Lapang Bagian Produksi Ternak Ruminansia Kecil Fakultas Peternakan IPB dan Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi, Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Pembuatan pelet ransum komplit berbasis daun Indigofera zollingeriana dan daun lamtoro dilakukan di Pabrik Pakan Indofeed, Bogor. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan November 2011 sampai Januari 2012. Materi Ternak Penelitian ini menggunakan 20 ekor kelinci jantan lokal peranakan New Zaeland White periode lepas sapih umur 4 bulan, dengan bobot hidup rata-rata sekitar 1653,36±265,46 g/ekor (Gambar 1). Gambar 1. Kelinci Penelitian Kandang dan Peralatan Kandang yang digunakan adalah kandang individual bertingkat sistem baterai yang terbuat dari besi. Kandang yang dipakai sebanyak 20 dengan ukuran panjang 75 cm, lebar 60 cm dan tinggi 50 cm. Setiap kandang dilengkapi dengan tempat pakan dan air minum. Peralatan lain yang dibutuhkan adalah timbangan untuk mengukur bobot badan kelinci, plastik, alat kebersihan kandang, tabung reaksi, mikro pipet, bunsen, kompor listrik, dan penyerap oksigen, alat penampung semen, mikroskop, dan vagina buatan. 14
Gambar 2. Kandang Kelinci penelitian Bahan Lain Untuk koleksi dan evaluasi kualitas semen diperlukan jelly, air panas, NaCl fisiologis, dan larutan eosin negrosin 2%. Bahan-bahan tersebut didapatkan dari Unit Rehabilitasi Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Ransum Penelitian Ransum standar (R0) yang digunakan merupakan pelet ransum komersil kelinci yang berasal dari Pabrik Pakan Indofeed dengan komposisi bahan pakan yaitu jagung kuning, dedak padi, dedak gandum, bungkil kedelai, bungkil kelapa, molasses, rumput, antimold, antioxidant, vitamin serta mineral. Pelet ransum komplit yang dibuat dengan sumber hijauan daun tanaman Indigofera zollingeriana dan daun lamtoro dan bahan lain diantaranya Jagung, dedak, CGM (Corn Gluten Meal), Bungkil kedele, Bungkil Kelapa, CaCO 3, premix, DCP (Dicalcium Phosphate), NaCl dan tepung ikan. Ransum komplit diformulasikan sesuai dengan kebutuhan kelinci periode pertumbuhan berdasarkan NRC (1977) dengan menggunakan Winfeed 2.8. Ransum komplit ini disusun sesuai dengan kebutuhan kelinci jantan, dengan pemakaian seperti disajikan pada Tabel 4. 15
Tabel 4. Komposisi Bahan Makanan Ransum Penelitian (% BK) Bahan Pakan Taraf Pemberian (%) R0 R1 R2 R3 R4 Ransum komersil 100 0 0 0 0 Daun Indigofera zollingeriana 0 0 10 20 30 Daun Lamtoro 0 30 20 10 0 Dedak padi 0 20 20 20 20 Jagung 0 30 30 30 30 Bungkil kedelai 0 11 11 11 11 Bungkil Kelapa 0 5 5 5 5 Tepung ikan 0 1 1 1 1 CGM 0 1 1 1 1 CaCO 3 0 0,5 0,5 0,5 0,5 DCP 0 0,5 0,5 0,5 0,5 NaCl 0 0,5 0,5 0,5 0,5 Premix 0 0,5 0,5 0,5 0,5 Jumlah (%) 100 100 100 100 100 Berikut ini adalah tabel hasil analisa pelet ransum komplit, R1, R2, R3 dan R4 dari Laboratorium Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Berdasarkan hasil analisis tersebut dapat diketahui bahwa secara umum pelet ransum komplit yang dibuat memiliki kandungan nutrisi yang relatif sama. Tabel 5. Kandungan Nutrien Ransum (% BK) Bahan Pakan (%) Taraf Pemberian (%) R0 R1 R2 R3 R4 Kadar Air 9,19 10,46 10,02 9,61 10,35 Abu 10,25 8,07 8,40 8,63 8,63 Lemak Kasar 6,68 6,46 6,79 7,07 5,29 Protein Kasar 15,74 17,90 18,95 21,06 19,00 Serat Kasar 9,76 8,16 7,60 8,45 8,11 BETN 57,57 59,41 58,26 54,79 58,97 TDN a 62,87 68,26 69,70 68,81 66,99 Sumber: Hasil Analisa Laboratorium Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB (2011); berdasarkan Rumus Hartadi et al. (1980), a % TDN= 22,822-1,44 (SK) -2,875 (LK) +0,655 (BETN)+0,863 (PK)+0,02 (SK) 2-0,078(LK) 2 +0,018 (SK) (LK) + 0,045 (LK) (BETN) -0,085 (LK) (PK)+ 0,02 (LK) 2 (PK) Keterangan: R0= Pelet Ransum komersil dengan 0% lamtoro dan 0% I. zollingeriana; R1= Pelet Ransum Komplit dengan 30% lamtoro dan 0% I. zollingeriana; R2= Pelet Ransum Komplit dengan 20% lamtoro dan 10% I. zollingeriana; R3= Pelet Ransum Komplit dengan 10% lamtoro dan 20% I. zollingeriana; R4= Pelet Ransum Komplit dengan 0% lamtoro dan 30% I. zollingeriana 16
Prosedur Persiapan Hijauan Hijauan yang dipilih sebagai bahan baku ransum komplit adalah daun I. zollingeriana dan daun lamtoro yang merupakan hijauan yang masih bentuk segar. Hijauan dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari selama ± 3 hari hingga kadar air bahan mencapai ± 12%. Pembuatan Pelet Ransum Komplit Bahan hijauan yang telah digiling dan berbentuk tepung dicampur dengan bahan pakan (Jagung, dedak, CGM, Bungkil kedelai, Bungkil Kelapa, CaCO 3, DCP, NaCl, premix dan tepung ikan) sesuai dengan formula pada Tabel 3. Bahan campuran tersebut dimasukkan ke dalam mesin pengaduk atau mixer agar semua bahan tersebut telah tercampur dengan rata. Tahap selanjutnya adalah pelleting yakni memasukan semua bahan yang telah tercampur ke dalam mesin pelet dengan ukuran 3 mm. Pelet yang akan dihasilkan selanjutnya diangin-anginkan dan dimasukkan ke dalam karung sesuai dengan perlakuan. Persiapan Kandang Kandang sebanyak 20 buah sebelum digunakan dibersihkan terlebih dahulu. Kemudian kandang dilengkapi tempat pakan dari keramik dan tempat minum dari botol minum khusus. Pemeliharaan 20 ekor kelinci jantan lokal peranakan New Zealand White lepas sapih periode lepas sapih umur 4 bulan, dengan bobot hidup rata-rata sekitar 1653,36±265,46 g/ekor dibagi menjadi 5 perlakuan ransum yaitu: R0 = Pelet ransum komersil kelinci R1 = Pelet Ransum komplit dengan 30% lamtoro + 0% I. zollingeriana R2 = Pelet Ransum komplit dengan 20% lamtoro + 10% I. zollingeriana R3 = Pelet Ransum komplit dengan 10% lamtoro + 20% I. zollingeriana R4 = Pelet Ransum komplit dengan 0% lamtoro + 30% I. zollingeriana Ternak dipelihara dalam kandang individu selama 7 minggu. Dua minggu pertama sebagai masa adaptasi pakan (preliminary). Adaptasi pakan dilakukan 17
hingga kelinci mampu mengkonsumsi pakan yang akan diuji cobakan hingga 100% (tidak ada sisa) tanpa mengalami penurunan konsumsi dan bobot badan. Kemudian minggu ke-3 sampai ke-7 dilakukan pengamatan dan pengambilan data. (R0) (R1) (R2) (R3) (R4) Gambar 3. Pakan Perlakuan R0 = ransum komersil; R1 = 30% lamtoro, 0% I. zollingeriana; R2 = 20% lamtoro, 10% I. zollingeriana; R3 = 10% lamtoro, 20% I. zollingeriana; R4 = 30% I. zollingeriana Pakan dan air minum diberikan ad libitum. Pemberian pakan dilakukan dua kali sehari, pada pagi hari pukul 06.00 07.00 WIB dan sore hari pada pukul 16.00 17.00 WIB. Koleksi Semen Koleksi semen dilakukan pada akhir penelitian yaitu pada minggu ke-7 penelitian sebanyak satu kali penampungan dari masing-masing kelinci perlakuan. 18
Penampungan dengan menggunakan vagina buatan yang dipancing menggunakan kelinci betina dewasa. Semen yang sudah tertampung dalam tabung kemudian diambil sampelnya untuk dideterminasi baik secara makroskopik maupun mikroskopik. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan Rancangan percobaan pada awal penelitian menggunakan Rancangan Acak Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 5 perlakuan dan 4 kelompok. Kelompok dalam percobaan kali ini adalah bobot badan kelinci jantan New Zealand White yang dibagi menjadi 4. Empat kelompok adalah jumlah kelinci jantan New Zealand White untuk masing-masing perlakuan yang merupakan perwakilan dari tiap kelompok. Model matematika rancangan tersebut adalah sebagai berikut: Y ij = µ + τ i + ß j + ε ij Keterangan: = rataan umum i = efek perlakuan ke-i ß j = efek kelompok ke-j ij = eror perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Analisis Data Pada awalnya dianalisis dilakukan dengan sidik ragam sesuai dengan rancangan percobaan, tetapi karena koefisien variasi data sangat tinggi (mencapai 95,5%) sehingga perbedaan nilai rataan tidak menunjukan perbedaan secara signifikan secara statistik, sehingga analisis data dilakukan dengan menggunakan menggunakan statistika deskriptif. Selain tingginya variasi antar perlakuan, terdapat beberapa ekor individu kelinci yang tidak dapat menghasilkan semen, sehingga jumlah sampel tidak memenuhi ketentuan untuk sidik ragam. Peubah yang diamati Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah ph, warna, volume, konsistensi, gerakan massa, konsentrasi spermatozoa, persentase viabilitas, persentase motilitas, abnormalitas, serta nilai HOS Test. 19
ph Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan kertas indikator ph. Nilai ph dapat diketahui melalui indikasi yang terlihat dari perubahan warna pada kertas indikator ph tersebut. Gerakan Massa Pemeriksaan gerakan massa dilakukan dengan cara satu tetes semen diletakan pada object glass yang bersih dan hangat (jangan terlalu cembung supaya cahaya mikroskop dapat menembus semen). Preparat yang sudah jadi kemudian diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 10 kali terhadap pergerakan massa spermatozoa. Spermatozoa mendapat nilai (-) jika tidak ada gerakan, (-/+) jika ada sangat sedikit gerakan, (+) jika ada sedikit gerakan, (+/++) jika terjadi gerakan yang agak besar, (++) jika terjadi gelombang gerakan yang besar, (++/+++) jika terjadi gelombang besar yang hampir menyerupai gumpalan awan yang menggulung dan (+++) jika terjadi gerakan seperti awan yang menggulung. Volume Pengamatan volume dilakukan dengan cara pengamatan langsung pada tabung penampung semen yang memiliki skala. Semen ditampung seluruhnya dalam tabung penampung yang bermulut lebar untuk sekali ejakulasi kemudian volume di dalam tabung diukur dengan gelas ukur yang mempunyai skala volume 0,1 ml kemudian dibaca hasil yang ditunjukan oleh skala. Kekentalan (konsistensi) Kekentalan diukur dengan cara memiringkan tabung sebesar 45 o kemudian ditegakkan kembali ke posisi semula, dilihat dari kecepatan ejakulat kembali pada posisi semula. Ejakulat memiliki nilai kental (K) jika waktu kembali ke posisi semula sangat lambat, ejakulat memiliki nilai sedang (S) jika waktu kembali ke posisi semula lambat dan ejakulat memiliki nilai encer (E) jika waktu kembali ke posisi semula cepat. 20
Warna Semen yang ada di dalam tabung reaksi diamati dengan menggunakan latar belakang putih dan dilakukan di tempat yang mempunyai penerangan cukup. Warna ejakulat terdiri dari tiga warna, yaitu: putih (P), krem (C), dan krem keputihan (C-P). Konsentrasi spermatozoa Konsentrasi spermatozoa merupakan jumlah spermatozoa yang terkandung dalam setiap milliliter semen. Sebanyak 10 µl semen kelinci dicampurkan dengan 990 µl pengencer. Keduanya dicampurkan pada tabung eppendorf dengan menggunakan mikropippet kemudian campuran dihomogenkan dengan memutar tabung seperti angka 8. Campuran semen kemudian diambil sebanyak 8-10 µl dan dimasukan ke counting chamber. Preparat kemudian diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 400 kali. Pada counting chamber (Neubauer Chamber) dipilih 5 kotak besar kemudian di dalam masing-masing kotak besar terdapat 16 kotak kecil. Kemudian dihitung dengan menggunakan rumus : Jumlah spermatozoa per ml = N x 5 x FP x 10.000 Di mana N = Jumlah spermatozoa yang ada di chamber (5 kotak besar yang terdapat 16 kotak kecil) FP = Faktor pengencer ( 100, 200, atau 500 ) 5 = Faktor koreksi di mana hanya 5 dari 25 kotak yang dihitung 10.000 = Faktor koreksi yang dibutuhkan karena di dalam cover slip.0001 ml per chamber. Persentase motilitas Persentase motilitas adalah perbandingan spermatozoa yang bergerak ke depan (progresif) dibandingkan dengan jumlah spermatozoa yang diamati. Semen diambil dengan pipet plastik kemudian diteteskan pada object glass sebanyak satu tetes dan ditambahkan NaCl fisiologis sebanyak satu tetes. Campuran tersebut ditutup dengan cover glass. Jumlah spermatozoa motil progresif diamati menggunakan mikroskop listrik dengan pembesaran objektif 40 kali pada sepuluh kali lapang pandang yang berbeda (atau 200 spermatozoa) dengan cara berurutan dan 21
zig-zag. Penilaian yang diberikan dari angka 0% (tidak ada yang bergerak) sampai dengan 100% (seluruh spermatozoa bergerak ke depan). Viabilitas dan abnormalitas Object glass yang bersih dan bebas lemak disiapkan sebanyak 3 buah.pada glass objek yang pertama diteteskan negrosin 2% sebanyak 1 tetes dan dicampurkan semen sebanyak 8 tetes. Negrosin dan semen kemudian dihomogenkan. Kemudian object glass kedua digunakan untuk mengambil sedikit campuran di ujungnya dan diulas pada glass objek ketiga. Object glass ketiga kemudian dikeringkan di bunsen selama 10-15 detik. Preparat ulas yang sudah dibuat diamati di mikroskop. Spermatozoa yang masih hidup akan berwarna putih dan yang mati akan berwarna merah. Pada pengamatan viabilitas dapat dilakukan pengamatan normalitas dan abnormalitas. HOS test (Tes keutuhan membran plasma spermatozoa) Menurut Jeyendran dan Zaneveld (1986), pembuatan larutan HOS test dilakukan dengan mencampurkan 2,7 g fruktosa yang dilarutkan ke dalam 100 ml aquadest dengan 1,47 g natrium sitrat yang dilarutkan ke dalam 100 ml aquadest. Kemudian larutan hipoosmotik dimasukan kedalam tabung effendorf sebanyak 0,35 ml dan semen kelinci sebanyak 0,05 ml. Campuran kemudian diinkubasikan dalam incubator dengan temperature 37 o C selama 30 menit. Setelah diinkubasikan campuran tersebut diteteskan pada glass objek dan ditutup dengan cover glass. Kemudian diamati dengan mikroskop pembesaran 450 kali. Spermatozoa yang memiliki membran utuh pada bagian ekor akan terlihat melengkung sedangkan spermatozoa yang tidak mempunyai membran pada bagian ekor akan terlihat lurus. 22